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        PCR 法

        相关实验:痘苗 DNA 检测实验

        最新修订时间:

        原理


        材料与仪器

        步骤

        实验试剂准备详见「其他」。


        1. 吸出汇片生长单层细胞的培养基。


        1.1 对于 XGPRT 筛选,用 BS-C-1 细胞。


        1.2 对于 TK 筛选,用 HuTK-143B 细胞。


        2. 用 37℃ 的 PBS 或胰酶/EDTA 洗细胞 1 次,以除去剩余血清。


        3. 用刚好覆盖单层细胞、37℃ 的胰酶/EDTA(对于 150 cm2 培养瓶需要 1.5 ml)覆盖细胞。消化 30 s (细胞应该分开),晃动培养瓶使细胞完全分开。


        4. 加入 8.5 ml 适当培养基。


        4.1 对于 BS-C-1 细胞,使用完全 MEM-10 培养基


        4.2 对于 HuTK-143B 细胞,使用完全 MEM-10/BrdU 培养基。吸打细胞悬液数次使团块散开。


        5. 用血球计数器对细胞进行计数。


        6. 将 1.25 ×105 细胞/孔放入 24 孔组织培养板培养(每孔终体积为 0.5 ml),至细胞汇片(应小于 24 h)。


        7. 将小管中的病毒置于冰水上,在杯状超声仪上以最大功率超声 20~30 s。


        8. 吸出组织培养板中的培养基,用一个重组病毒噬斑感染一个孔的细胞,一般用噬斑悬液的一半体积(如有0.5 ml 的噬斑悬液用 0.25 ml),温育 1~2 h,期间每隔 15~30 min,轻轻摇晃培养瓶。


        9. 加入 1 ml 含适当筛选试剂的完全 MEM-2.5 培养基,培养直到细胞病变(细胞变圆)明显(一般 24~48 h)。


        9.1 对于 XGPRT 筛选,加入 1/400 体积的 10 mg/ml MPA、1/40 体积的 10 mg/ml 黄嘌呤、1/670 体积的 10 mg/ml 次黄嘌呤。


        9.2 对于 TK 筛选,加入 1/200 体积的 5 mg/ml BrdU。


        10. 用细胞刮刀轻轻刮下细胞,转移到离心管中,最大转速离心 30 s。弃培养基;再加入 1 ml PBS,涡旋混匀,最大转速离心 30 s 弃 PBS,用 0.5 ml PBS 重悬。


        11. 反复冻融法裂解细胞悬液:用干冰/乙醇冷冻细胞,再将细胞放入 37℃ 水浴锅,且涡旋解冻。如此进行 3 次。


        12. 将重悬的细胞悬液置于冰水混合物上,在杯状超声仪上以最大功率超声 20~30 s。


        13. 取 50~100 μl 细胞悬液移至微量离心管中。加入 1/10 体积的 DNA 提取缓冲液,轻轻翻转数次使其混合,37℃ 放置 2 h 至过夜。


        14. 用等体积的平衡苯酚抽提 1 次,再用等体积的氯仿抽提 1 次。


        15. 加入 1/10 体积 pH 6.0,3 mol/L 的乙酸钠(终体积为 0.3 mol/L)和 1.5 体积 95% 的乙醇。 -20℃ 放置 20 min。


        16. 4℃ 以最大转速离心 15 min,弃上清。用冰浴的 70% 乙醇洗涤,空气中晾干。


        17. 用 20 μl 去离子水溶解沉淀。在冰上配制下列反应混合物:

        10 μl 溶解的模板 DNA

        5 μl 10 × 无 MgCl2 的 PCR 扩增缓冲液

        5 μl 10 mmol/L 4 dNTP 混合物

        5 μl 100 μmol/L 引物

        5 μl 15 mmol/L MgCl2

        24.5 μl H2O

        覆盖上矿物油。

        此步骤使用高保真的 PCR 试剂盒(BoehringerMannheim)更好。


        18. 用下列热循环参数进行 PCR 反应。

        35 个循环:20 s 95℃ (变性)

        20 s 55~60℃ (复性)

        1~2 min 72℃ (延伸)

        1个循环:5 min 72℃ (延伸)

        最后一步:无限时 4℃ (保存)

        此条件适合扩增 1 kb 大小的片段。


        19. 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。

        注意事项

        1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养,除非有特殊说明。


        2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的,操作也必须无菌。

        常见问题

        试剂:

        磷酸缓冲液(PBS)

        胰酶/EDTA(0.25%:0.02%),37℃

        完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培养基

        完全 MEM-10/BrdU 培养基

        筛选试剂(过滤除菌,-20℃ 保存):

        10 mg/ml(400×)麦考酚酸(MPA;Calbiochem),溶于 0.1 mol/L NaOH(XGPRT 筛选);

        10 mg/ml(40×)黄嘌呤,溶于 0.1 mol/L NaOH(XGPRT 筛选);

        10 mg/ml(670×)次黄嘌呤,溶于 0.1 mol/L NaOH(XGPRT 筛选);

        5 mg/ml(200×)5-溴脱氧尿苷(BrdU),溶于水(TK 筛选)

        干冰/乙醇

        DNA 提取缓冲液

        3 mol/L 乙酸钠,pH 6.0

        95% 和 70% 冰浴的乙醇

        10 × 无 MgCl2 的 PCR 扩增缓冲液

        10 mmol/L 4 dNTP 混合物

        100 μmol/L 引物(序列按照插入的外源基因的位点设计)

        15 mmol/L MgCl2

        来源:丁香实验

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