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        PCR产物的检测PCR-ELISA法

        互联网

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        在一个引物的5’端标记上生物素以便使其能与包被板上的亲合素结合而固定PCR产物,而在另一引物的5’端标记FITC,用HRP标记的抗FITC抗体与之结合显色,即可进行常规ELISA检测。如设立标准对照,此技术还可用于定量分析。

        试剂与配置

        包被液:4.3mmol/L Na2HPO4 , 1.4mmol/L K2 HPO4, 0.05% (w/v) Tween20, 40mmol/L NaCl, 2.7mmol/LKCl (pH7.2)

        链霉亲和素(13U/mg, Sigma):用包被液配置为1μg/ml;

        HRP标记的抗FITC抗体:用包被液稀释至工作浓度

        显色液:1mg/ml的TMB(溶于DMSO),用50mmol/L乙酸钠-柠檬酸(pH4.9)稀释10倍;

        终止液:2mol/L H2SO4

        30%过氧化氢

        操作方法

        1. 在酶标板的每孔中加100μl链霉亲和素,室温包被过夜;

        2. 室温下,用包被液洗2次;

        3. 1μl PCR产物用50μl包被液稀释,加入孔中,室温放置30min;

        4. 包被液洗3~6次,每孔再加入50μl HRP-抗FITC抗体,室温作用30min;

        5. 包被液洗3~6次,加入30%过氧化氢3μl,显色液80μl,室温放置2~5min,观察颜色变化;

        6. 加入终止液终止反应,酶标仪上测OD450nm 值。

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