实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问细胞培养中霉菌污染问题

丁香实验

1.细菌污染液体混浊,霉菌污染可看见霉苔但液体不混,所以你的细菌和霉菌同时污染处理:扔掉,以免污染其他细胞2.你说的线状生长实际上细胞已经接近死亡3.可以将培养箱用75%的酒精擦拭,并停止细胞培养,然后用紫外消毒房间

1 回答530 围观

问细胞复苏失败的原因分析

丁香实验

juventus2004认为复苏过程没有问题，是否是从液氮拿出直接放入温水，还有培养箱，二氧化碳浓度，培养基、PH值等环节。要么加高浓度FBS 15-20%，看看能否帮助贴壁，当然也需要考虑血清问题，还有确信拿来的细胞没问题。pcspc9认为首先应该怀疑冻存，实际上复苏出问题的可能非常小，因为操作简单，而且死板。1、你冻存的时候是不是消化的时间过长，这是一般人所注意不到的，即使书上也不讲这个问题，

1 回答1063 围观

问如何观察细胞污染？

丁香实验

观察细胞污染首先要从培养液的外观来看，看培养液是否清亮。当然，刚刚加入培养液是看不出来的。必需经过隔夜培养或更长时间才能看出来。如果培养液变混浊，则可断定细胞污染。其次，是从显微镜下观察，因细菌很小，所以观察时眼睛盯住一个视野，你会看见细小的黑点在动，细胞是不会动的，因此，可以断定那就是细菌。以上是小可培养细胞来观察污染的一点体会，仅供参考。不过以上情况还是少见或不见好，那就表明你的细胞养的好。

1 回答3274 围观

问诱导表达不出蛋白

ZhangDss

后来实验室的老师建议我用BL21（DE3）plys表达，现在还在试，不知道是不是菌种的原因。

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问蛋白表达自动诱导系统以及大幅度提高产量

lithlin00

包含体的形成与否与普通IPTG诱导的结果相当，我经验看来，可溶性的效果上可能还好些，因为乳糖的诱导不同于IPTG，它要经过好几个过程，同时它又是碳源之一，所以它的诱导是很温和的一个过程，而IPTG是很剧烈的一个过程，浓度高的时候，蛋白的折叠速度就会跟不上表达速度，导致包含体的形成。我在IPTG诱导时的两个可溶性蛋白，在5052系统中也是完全可溶的。我一直用的Rosetta(DE3)plys，你应该

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问能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达

dupli

完全可以，楼主所说共表达不是融合表达，是共同表达。如果是真核表达，把两个表达框构建到一个载体上进行转化或转染就可以实现共表达了,有一些现成的用于共表达的载体。动物细胞中还有IRES载体可用于共表达。如果是大肠杆菌或其他原核生物共表达，可以构建两个顺反子到一个载体上，但是步骤可能会比较多，载体比较大，可能会影响质粒复制而影响表达效果。而如果两个顺反子有较大同源部分，则还需要考虑因重组导致的不稳定。N

3 回答2828 围观

问RT－PCR在RNA干扰中是否还有作用？

zhuqueleee

我觉得你的方法有点问题的。你不应该仅仅通过观察RNAi前后实验组、空白组的cDNA含量变化来监测RNAi效果，而是应当把空白组和实验组再各设一个看家基因对照，通过看家基因和目的基因的量的对比，从而观察你的RNAi效果。个人意见，希望对你的实验有所帮助。

3 回答520 围观

问怎样用流式细胞仪来鉴定小鼠BMDC？

丁香实验

检测小鼠BMDC主要是从形态学和细胞表面分子两方面来鉴定我做的时候就做了普通光镜下形态、电镜（扫描和透射），另外检测了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86、CD11、CD80。还做了MHC II类分子的检测，还有MHCI类分子的检测，这些分子在DC表面都不是特异存在的，在巨噬细胞、淋巴细胞表面也有表达，所以目前并没有非常特异性的方法检测你的细胞一定就是DC，但是从形态和表面分子的检测结合来看，效

1 回答739 围观

问RNA提取中的问题

老鹰归来

75%的乙醇哦亲，室温即可哦亲。配置75%乙醇的水必须经过DEPC处理哦亲。原理：之所以用乙醇是为了让RNA析出哦亲，之所以不用纯乙醇而用75的乙醇是为了溶解RNA提取过程中的胍盐等可溶杂质哦亲，用纯乙醇而不用75的乙醇洗涤RNA会导致最后260/230的比值小于2.0哦亲。260/230低于2.0可以做反转，定量，但是不可以用于测序哦亲。提问者：那也就是说最后一步非要用带水的乙醇对吧，其实真正起

2 回答1737 围观

问RNA提取，rtPCR和qPCR碰到的问题

wangqing2020

取完一个标本后，趁研钵还是很冷的状态下，向研钵中加一勺（用不锈钢的小汤勺即可）液氮，立刻用研棒搅动样品，趁样品飘在液氮中，将样品和液氮一起倒到锡箔纸做成的小碗中（用来收集废样，便于丢弃）。如果一次洗不干净，可以多洗两遍，我都是这样做的，一般洗两次就很干净了。

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问如何灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解？

丁香实验

以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活：（1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。（2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活（3）立即将样品置于RNAlater? Tissue Collection：RNA Stabilization Solution中。它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未

1 回答1444 围观

问细胞胞质疏松，状态不好，养不起来怎么办?

丁香实验

——解决办法1：一般情况下，从血清下手就行，要么换好血清，要么提高血清浓度，血清浓度提高到 15%～20% 培养 48 h，换成正常 10% 的浓度，用高浓度的血清培养时间过长对细胞有毒性。——解决办法2：血清下手之后可以同时采取提高细胞密度的方法，从培养瓶换到六孔板，12 孔板等，细胞密度大，细胞分泌的细胞因子多，肿瘤细胞通过旁分泌途径促进细胞生长。——预防办法：细胞胞质疏松，老化的原因在于细胞

1 回答694 围观

问引物合成引物有两个Tm值，如何确定PCR的退火温度？

zcldf001

以第一对引物为例：主要的问题是上游引物有稳定的loop，需要提高退火温度，引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率，这样就需要同时增加引物的量。摸索退火温度是要参考Tm，不确定各个公司引物合成单上的计算方法，你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的：0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度，因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。用o

1 回答1214 围观

问设计好的引物如何在NCBI 上比对?

goleo

引物比对在ncbi主页www.ncbi.nlm.nih.gov/上点blast，然后选择左上角那个版块里的search for short，nearly exact matches，输入上游引物序列，在下一行输入下游引物序列，选择你要看的种属（没有特殊要求就选择nr），点submit，在下一个窗口中点format，就可以了。这样是看一对引物的特异性。

5 回答6861 围观

问实时荧光定量试验，是否需要均一化处理？

剑藏鞘

内参的选择也很重要

2 回答819 围观

问怎么 RT－PCR 老不出结果

zhangcs

我的目的基因长度是580bp，第一次三管p出来的也是580bp，污染或杂带也不会这么巧就出现在这个位置吧，另外我用的是同一台pcr仪，同试验室的师兄也用这台pcr仪，没问题呀，至于条件，我做过很多次梯度了，循环次数也改了很多次，由于我的目的基因比较长，4500bp，而且产物片断也比较长，我怀疑是不是目的基因断成小片断了，我因此也重提了很多次RNA,但还是不行呀，我下一步该怎么办，帮帮我吧，谢谢了！

1 回答534 围观

问如何排除RT－PCR

life

结合个人实验，我觉得有两种方法可以佐证（1）如果你的正反向引物或只有一侧的引物可以设计在EXON的边缘，你可以在设计时，让一个引物的一部分跨过一个内含子，这样从DNA上是拉不到产物的，只有从CDNA上可以得到。（2）验证是否存在DNA污染，你也可以用其他已知基因的引物从DNA和CDNA拉出片段的差异来看你的模板中是否有DNA你可以结合验证，另外DNase消化时要充分

4 回答501 围观

问关于 RT－PCR 的 RNA 提取

qjm7717

用飞捷的试剂盒试试，15分钟搞定，当然组织可能稍微费时一点。

9 回答474 围观

问免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。

丁香实验

关于抗原修复，我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是

1 回答941 围观

问细胞转染后总是污染，求指教

波儿小芒

我建议你换个液看看，看镜头里面的图片，不太像是典型污染。如果液体不澄清，背景脏，那可能真的是污染。没事儿，你正常换液，主要操作的时候别与其他细胞一起操作。每次换液的时候，先用双抗原液清洗一下细胞。就算是细菌污染也不太要紧，一般通过抗生素洗涤和换液频率都能够挽救回来。当然了，如果你的细胞不是很珍贵，那你要评估一下有没有挽救的必要。

4 回答2101 围观

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