WB内参跑不齐的原因是什么？
丁香实验
同样的样品和上样量，其他条件也全部一样，两块胶跑出来的内参就是不一样，为什么呢？目的蛋白正常表达，如何解决？ 
18 个回答
隔壁家的小夜猫子
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细胞收的时候量不一样，测浓度，重新normalize
JCorona
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可能的原因：1.胶的内部浓度不均匀或者凝固得不好；2.电泳槽质量问题，电压分布不均匀；3.缓冲液的问题
一支肾上腺素
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内参跑不齐。一般是跑胶时电流或电压太大。还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐。
红格子一号
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控制蛋白上样量一致，用新鲜的胶和电泳液
ZZDX-YILILI
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1.样本都是一样的话，两次实验之间间隔了多久，是不是样本时间长了有点降解。
2.还有就是一抗和二抗是否使用次数多了，实际蛋白是一样的，尤其抗体使用次数多了，导致灵敏度下降，最终显示含量不一样。
3.如果排除上面两个原因，重复实验还是这样的话，那你最终取结果的时候可以根据灰度值做下统计比较。
dxy_h7vcp8v3
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首先蛋白条带的量不一致，检查自己制做内参样品的时候，是否每组都进行定量。例如，每组都取1ml菌液离心得沉淀蛋白。其次，每组内参的细胞培养物的浓度是否一致，建议吧OD调一致在进行取样。其次，可以对内参样品进行测定浓度，然后取等量上样跑胶。 同时，你的蛋白胶制备也不好，胶条变斜，说明你电压过快，或者浓缩胶没制备好。建议增强蛋白电泳这方面知识。
dxy_bq4uxnd
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你这个蛋白WB结果上内参有好多非特异的条带，怀疑是内参抗体的特异性不行，显出了其他非特异的蛋白，影响了结果
jey1235
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如果真的是完全一样的样品和完全一致的上样量的话，参差不齐的IB只会出现在转膜和抗体一步。
转膜是要注意是否平整，buffer是否稀释均匀，可能会是转膜体系不一致。
抗体的话要考虑是不是孵育的时候有膜暴露出来或者没有均匀孵育。
最后就是block的步骤，牛奶或者BSA是否存在结块。
dxy_pni5ki46
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首先是样品溶解性和均一性没有那么好，大分子物质实际上不是完全均一分布的，再一个就是存在加样误差等。加样前检查一下样品有没有沉淀，多吹打混匀，同一个样品重复加样时换枪头
dxy_pggo2lp2
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建议换个内参。我们组有次选actin跑不出来，换了GAPDH就跑出来了。
dxy_4uyyu09r
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除了第二块胶有少许杂带，你这两次的结果相差不大，内参相差太大了，需要仔细看看不同样品是否影响了内参的表达，建议换一个内参试试，如果还这样里你样品处理的问题了
z流沙z
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上样前充分混匀，如果用枪头吹打混匀，认真观察可以发现其实最后会多吸出一点
dxy_qkedgrg7
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那应该就是内参抗体的问题，我之前也遇见过这种，不过也可能是测浓度的试剂盒失效了，或要重新做标曲了，如果浓度测的没有问题就是抗体问题了
bamboopiggy
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这个和你的真正的上样量，转膜的接触，还有抗体的孵育等都可能有问题，最大的可能就是上样不是那么准
vae1476
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胶是同时做的吗？要注意，上样前充分涡旋，保持均匀，另外就是注意观察，跑胶的时候有无漏胶
Guoood
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内参不齐很大原因是蛋白定量不准确。提取蛋白后测定浓度我用的是BCA法，要确保标准曲线R在0.99左右，可以比较准确的定量，基本不会出现内参不齐。还有一个原因就是转膜没转好，导致有些部分没转过去，建议排除下。
飞天幻雪
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抗体有问题了。不像是样品降解的问题，抗体用的次数多了会出现非特异条带。建议重新稀释一份抗体再做wb试试吧
verbalkint
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同一块胶上换个内参看看。有可能这个内参不适合这个细胞系。还有可能是内参的抗体没敷匀
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