目的抗体杂带太多，背景杂乱怎么办？

丁香实验

2022-01-12

目的基因2133bp，构建到PEGFP-C1这个载体里面，用lipo2000转染到HEK293细胞再提蛋白，浓度4ug/ul左右，上样量30ug,脱脂奶粉室温封闭1.5h，一抗四度过夜，洗膜3次，每次十分钟，二抗室温1h，洗膜4次，每次十分钟，显影。内参actin是CST公司的1：5000稀释，polyG抗体是公司做的1：7000，TAP952抗体是sigma旗下的1：5000已经做了很多次结果还是这样看不到特异性条带，背景也很杂乱。条带从左至右分别是空白（HEK细胞蛋白）、转染空载、转染目的基因，图片从上至下分别是actin、polyG抗体、TAP952抗体，怎么解决？（GFP标签在基因的前后都有连过，而且转染进细胞后都有发荧光，提取细胞的RNA用目的基因的引物也能扩出来；polyG是兔抗，TAP952是鼠抗）

17 个回答

verbalkint

2022-01-21

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抗体不好，要么做ip检测，要么直接用标签抗体（gfp）不要用蛋白自己的抗体

隔壁家的小夜猫子

2022-01-21

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感觉表达量不太高啊，你用荧光check一下转染量没有。抗体的特异性不咋样，可以换一只。

JCorona

2022-01-21

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导致背景杂乱可能的原因有：1.封闭、洗抗体等过程中没有注意给膜保湿；2.封闭不完全；3.抗体浓度过高导致非特异吸附

ZZDX-YILILI

2022-01-21

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看内参表达量你样本中蛋白质浓度应该是相对比较高的，后面那两个没有显示出来，我怀疑1.确定一抗是不是适合做WB。2.RNA水平有表达的话，蛋白质目前没有看出来过表达，有可能是蛋白质翻译后进行了加工修饰，所以蛋白水平暂时没有检测到。如果是膜蛋白的话，建议流式检测下。

dxy_h7vcp8v3

2022-01-21

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GFP能发荧光，不代表是自己蛋白融合表达，建议首先用方法吧自己目的蛋白纯化出来，跑蛋白胶，用考马斯亮蓝染色检测是否自己目标蛋白已表达，如果表达在进行后续实验。其次，如果确定自己抗体没问题的话，建议下次跑胶带个阳性对照，确定实验步骤及试剂没有问题。大概率是自己蛋白没表达所以检测到，或者自己蛋白表达为包涵体蛋白，建议还是自己纯化看看。