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为什么有的蛋白可以测磷酸化有的测不了？

相关实验：蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)

丁香实验

2022-01-12

Western Blot测蛋白的时候，之前测的mTOR就是P和总的都能买到抗体测，但是最近做的TNF-a,只有一种抗体。为什么有的蛋白可以测磷酸化和总蛋白，有的蛋白就只能测一种?那这种蛋白计算具体数据的时候，是用beta-actin算么？是因为磷酸化位点测不到么？如果没有磷酸化修饰，我检测总蛋白是不是没有意义啊？

15 个回答

一支肾上腺素

2022-01-21

有帮助

磷酸化蛋白可能仅占细胞总蛋白中的一小部分，处理不得当时，还会快速的去磷酸化。磷酸化蛋白质 WB 做不好的原因有许多，比如封闭问题，抗体问题，或所需的磷酸化蛋白可能不存在于样品中或者低于 WB 检测的量。

dxy_pni5ki46

2022-01-21

有帮助

我的理解是蛋白磷酸化本身不稳定在胞外容易去磷酸化，并且蛋白磷酸化需要激酶参与，所以大部分激酶都是定位胞浆中，主要参与信号通路受体的激活，通过分泌途径的激酶目前只见到Fam20C的报道，并且它似乎主要作用是使生物矿化相关的分泌性钙结合蛋白磷酸化，调控磷酸钙沉积。所以我觉得tnf-alpha这类细胞因子不需磷酸化就可以行使功能，所以检测总的tnf-alpha就可以。

jey1235

2022-01-21

有帮助

看了下回答大部分都在胡扯。都搞不清楚抗体怎么制备的吗？？？？？你拿到的A蛋白抗体大部分只不过是用A上的一截peptide去免疫的。磷酸化同理，你需要知A蛋白具体磷酸化的位置比如48site 你就要制备包含p-48位置的peptide 去免疫。这样你的抗体就是特异 p-A抗体。这个抗体一般既能表征A蛋白，虽然一般不这么做，又能表征p-A水平。其他的我不说了。求求有些人不要误人子弟了。多去学习一下吧

ZZDX-YILILI

2022-01-21

有帮助

1.磷酸化是个很迅速的并且可逆的过程。磷酸化的检测需要考虑很多因素，比如蛋白质提取时加入磷酸酶抑制剂，蛋白质保存等多方面因素。我看你说TNF那个不能做，没有相应抗体，应该不是不能做，大致是因为磷酸化不易检测到，所以基本没有这个抗体。 2.另外，你说检测总蛋白没有意义，这个不是这样的，如果这个蛋白是磷酸化发挥一定作用，那有必须深入研究，如果说就是总蛋白的变化发挥作用，那只研究总蛋白就可以了，没有必要去多做磷酸化的是吧。

dxy_bq4uxnd

2022-01-21

有帮助

有些蛋白会发生磷酸化修饰，有些蛋白不能发生磷酸化修饰，比较时不应该再使用内参蛋白，而是应该使用目的蛋白的total蛋白做对比

水深先试浅

2022-01-20

有帮助

不是所有的蛋白的激活都是磷酸化吧，总蛋白只是一个到最后起到参考和计算表达量的作用吧，个人了解仅供参考

verbalkint

2022-01-20

有帮助

是因为没有商业化的磷酸化抗体，这种情况可以自己做抗体或者用phostag。磷酸化一般是活性状态的蛋白，有时候总蛋白没什么变化

隔壁家的小夜猫子

2022-01-20

有帮助

可能是被磷酸化那段的特异性不强，所以没有专门的抗体，这种情况下需要先做个IP，把目的蛋白抓出来，再用广谱磷酸化的抗体抗。

dxy_h7vcp8v3

2022-01-20

有帮助

蛋白质磷酸化测定，可以采用LC-MS质谱测定。您的蛋白只有一种试剂盒，可能是关于您蛋白的研究比较少，没有相应的厂商生产制造，也可能是总蛋白磷酸化试剂盒您没有找到，建议查找文献找与您目的蛋白一致的文献看是否有具体实验试剂盒。其次，磷酸化位点测定采用LC-MS可以定性分析，也可以定量分析，建议您后续查查文献采用质谱分析。

dxy_pggo2lp2

2022-01-20

有帮助

这个问题让我疑惑？可能是我自身水平有些，TGF-α是通过磷酸化发挥做用的吗？我看到的文献里都没有说TGF-α磷酸化，倒是其激活EGFR的磷酸化，对下游通路产生活化。我觉得应该是检测下游效应蛋白的磷酸化更有意义，这说明TGF-α的改变对下游通路产生的影响。检测下游磷酸化蛋白含量与TGF-α含量进行对比难道不能说明问题吗？

dxy_4uyyu09r

2022-01-20

有帮助

磷酸化后蛋白的大小是不一样的，一般都能用总蛋白看出来，只是有时有多个磷酸化后的条带时候，因为没有特异的抗体我们不能判断哪一条是我们要研究的磷酸化位点磷酸化的蛋白

bamboopiggy

2022-01-20

有帮助

因为mTOR是磷酸化以后才发挥作用，TNF-a我不太懂，但是感觉应该是直接发挥作用，所以不需要检测磷酸化水平。蛋白修饰有好多种，乙酰化的，磷酸化，甲基化等，你要具体分析你的蛋白的功能。你所谓的具体数据的计算，是想说内参吧？内参一般是管家基因，但是beta-actiin有时候也不能用，可能要用GAPDH，vinculin，tubulin，或者Histone 3，这个要看具体情况。

vae1476

2022-01-20

有帮助

测定磷酸化，一般是因为，某个位点磷酸化激活，会产生特殊的生物学效应，但如果这个磷酸化位点研究的人比较少，目前就有可能没有商品化的抗体，如果要测的话可以定制抗体。