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纯化方法相关问题
一支肾上腺素
一定要记住56℃30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。如果温度过高,时间过久或摇晃不均匀都会导致沉淀物的增多。
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问
K48、K63泛素蛋白质粒表达出来的泛素有何不同?
lzy必有我师
K48就是一般设计目标蛋白的降解,连接仍然是细胞通过蛋白水解降解维持体内平衡的关键途径最远端的泛素第48位赖氨酸被精氨酸取代,限制链长。 K63连接的多泛素化修饰蛋白质已经涉及DNA损伤反应的调节,内体分选,蛋白质错误折叠/聚集的自噬等细胞过程和神经退行性病变。这些四泛素链是由野生型泛素的酶促连接产生的。最远端的泛素含有精氨酸取代赖氨酸第63位,限制链长K63一般涉及翻译后修饰的功能获得或者失活。
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问
要送LC/MS液相色谱-质谱检测的co-IP胶条,操作全程注意事项?
一支肾上腺素
注意安全,有些试剂毒性很大,特别是后面处理,每一步都要小心注意。
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问
多肽浓度会比蛋白浓度还要高的原因?
JCorona
原因:1.蛋白质具有三级结构,许多折叠、卷曲的部位往往无法被检测到,造成检测值偏低,酶解后许多被隐藏的信号释放到表面,检测值趋近于真实值;2.酶本身也是蛋白质,若是酶的添加量过多,则酶会催化自身水解,造成多肽量增多
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问
蛋白质质谱组学相关问题
医往情深丁香园
应该是不能用了,时间有点长,建议重新做一次吧,不然试试重新做也行。
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问
蛋白结合为什么荧光公定位能做出来免疫共沉淀不行?
是小杨同学
我觉得可以试一下加大样本量呢,沉淀的蛋白量可能有多少,然后可以试一下优化ip条件
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问
coip的对照相关的问题
是小杨同学
我觉得可能是input的浓度有点低了呢,或者是抗体的问题,如果是抗体的话可以跑wb去验证一下
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问
IB条带模糊/无条带的原因?
lzy必有我师
:1.确定B的抗体是否适合做IP。 2.确定样本中B的含量是否太低。3.还有就是AB之间不存在互作。
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问
CO-IP之后的蛋白质和磁珠分离的方法相关问题
小布丁瑶瑶
0.5-4微克/mg 总蛋白即可 一般抗体浓度都很高 1:200-1:500左右
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问
input control是什么意思?
医往情深丁香园
就是裂解的蛋白原液,如果目的蛋白表达量正常,这个是很容易曝光出来的。
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问
目的蛋白和内参的条带形状反方向弯曲的原因?
lzy必有我师
如果蛋白样品足够的话还是建议跑两块胶,分别看内参和蛋白;如果一定要在同一张膜上面看的话,可以先看目标蛋白的表达,再用stripping buffer孵育去除一抗,再重新封闭,按照一样的步骤看内参,但这种方法比较不好掌控,stripping不到位,原本的抗体会有残留,stripping过度的话,再看内参的信号会很差
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问
条带宽度不一样目标蛋白性状奇怪并且拖尾严重的原因
dxyhsx123
上样的孔径是否均一,浓缩胶和分离胶比例是否合适,是否混匀,有无气泡,跑胶电压和速度等方面调整。
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问
为什么有的蛋白可以测磷酸化有的测不了?
一支肾上腺素
磷酸化蛋白可能仅占细胞总蛋白中的一小部分,处理不得当时,还会快速的去磷酸化。磷酸化蛋白质 WB 做不好的原因有许多,比如封闭问题,抗体问题,或所需的磷酸化蛋白可能不存在于样品中或者低于 WB 检测的量。
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问
转膜后蛋白异常的原因?
是小杨同学
我觉得可能是电压有点高,导致蛋白质降解了,然后可以换个电转仪器试试看
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问
GSTpulldown诱饵蛋白不结合柱子怎么办?
小布丁瑶瑶
可能是标签包起来了,可以尝试变性纯化
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问
WB电泳过程中上样孔样品残留怎么办?
俗人无了
相同的情况,作者是怎么解决的?
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问
免疫印迹中显色问题
是小杨同学
一般来说抗体的大小亚基是不会显色出来的吧,可以降低一下抗体的浓度试试
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问
WB内参跑不齐的原因是什么?
隔壁家的小夜猫子
细胞收的时候量不一样,测浓度,重新normalize
18 回答
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问
目的抗体杂带太多,背景杂乱怎么办?
verbalkint
抗体不好,要么做ip检测,要么直接用标签抗体(gfp)不要用蛋白自己的抗体
17 回答
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问
内参GADPH出现弥散,并且有两条条带是为什么?
是小杨同学
我觉得可能是你的蛋白降解了,然后出现了两条带,最好用新鲜的蛋白来跑胶呢
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