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CO-IP之后的蛋白质和磁珠分离的方法相关问题

29 个回答

小布丁瑶瑶

2022-01-20

有帮助

0.5-4微克/mg 总蛋白即可一般抗体浓度都很高 1:200-1:500左右

dxyhsx123

2022-01-20

有帮助

有专用的洗脱液可以洗脱分离的。另外就是建议利用克隆，表达纯化蛋白，这种量大方便实验。

JCorona

2022-01-18

有帮助

如果要保持蛋白质的结构与活性以便进行后续实验的话，建议使用克隆的方法直接获得高纯度蛋白产物；或者使用亲和层析的方法进行纯化。

lzy必有我师

2022-01-18

有帮助

1.样本+抗体先反应，然后加磁珠；2.抗体+磁珠先反应，然后放入样本中；3.样本+抗体+磁珠同时反应。推荐使用第一种和第二种，差别不大。不推荐用第三种，第三种方式虽然可以减少反应时间，但有实验表明同时加入三个组分的方式会使最终的结果变差。

dxy_bq4uxnd

2022-01-17

有帮助

如果需要保持结构和活性，建议在加入SDS上样缓冲液之间吸取一部分蛋白保存，剩余蛋白再加入SDS上样缓冲液。

dxy_w4oj7yoe

2022-01-17

有帮助

去一部分beads直接加loading煮样做wb 剩下的beads洗脱得到目的蛋白，多肽浓度参照商品说明使用，或者不放心的话可以先做个预实验试几个浓度梯度，不过体内直接拉下来的蛋白量通常都很低，生化实验建议直接用大肠杆菌或昆虫或哺乳动物细胞过表达蛋白，再进行纯化和后续相关实验

于小闹0808

2022-01-17

有帮助

多肽浓度在200-500ug左右，另外可以在配洗脱液的时候加一个洗脱的步骤，效果会更好

内科小护士

2022-01-17

有帮助

浓度500ug/ml差不多，标签抗体目前比较成熟，参考竞争性多肽说明书用量估计效果不会差。

医往情深丁香园

2022-01-17

有帮助

一般不推荐CO-IP。考虑换原核、真核表达体系，直接纯化获得蛋白。如果用这种方法，本身磁珠的结合就是依赖抗体-抗原，要考虑非特异性结合。

vae1476

2022-01-17

有帮助

其实co-up 更多用于分析相互作用，如果为了拿到蛋白样本，可以考虑换原核、真核表达体系，直接纯化获得蛋白。

一支肾上腺素

2022-01-17

有帮助

一般有三种反应顺序：1.样本+抗体先反应，然后加磁珠；2.抗体+磁珠先反应，然后放入样本中；3.样本+抗体+磁珠同时反应。推荐使用第一种和第二种，差别不大。不推荐用第三种，第三种方式虽然可以减少反应时间，但有实验表明同时加入三个组分的方式会使最终的结果变差。

是小杨同学

2022-01-17

有帮助

我觉得首先要避免使用过于剧烈的手段纯化，然后避免过度搅拌，多肽浓度大概是在200-500ug左右

bamboopiggy

2022-01-17

有帮助

如果想洗脱下来，进一步做结构和活性的话，建议用标签蛋白来做，因为洗脱要用到标签蛋白的多肽来进行，会比目的蛋白的多肽片段好获得。我用的是sigma的flag tag peptide，终浓度是500ug/ml，49ul+30ul两次来进行洗脱的。

dxy_rlratyf3

2022-01-17

有帮助

其他方法:使用凝血酶等特定位点剪切蛋白酶将磁珠上的蛋白完整剪切下来，需要co-ip的抗体存在特定氨基酸序列而抗原蛋白没有。浓度应该约等于或略高于靶蛋白的浓度。

小白野蛮成长

2022-01-17

有帮助

取一部分蛋白煮沸其余负八十保存多肽浓度可以在500左右

dxy_pni5ki46

2022-01-17

有帮助

我之前做pulldown用的生物素化抗体，洗脱可以用生物素，用标签蛋白的话用标签多肽也是可以的，浓度一般远大于你的目的蛋白的结合量，应该至少需要能使磁柱偶联的抗体饱和，然后才能开始竞争性洗脱下目的蛋白，可以根据磁珠说明书上的蛋白结合量算算大概用量。多洗脱几次测测蛋白浓度。另外做蛋白纯化的时候洗脱抗原可以用三乙醇胺缓冲液：50mmol/L三乙醇胺，ph 11.5，0.1% Triton X100，0.15mol/L NaCl，并不破环蛋白活性

jey1235

2022-01-17

有帮助

Co-IP一般只适用于小量蛋白的定性分析。题主想要获取蛋白就涉及到蛋白纯化，一般不推荐CO-IP。考虑换原核、真核表达体系，直接纯化获得蛋白。如果执意用这种方法，本身磁珠的结合就是依赖抗体-抗原，要考虑非特异性结合。使用竞争肽的量一般是目标蛋白产量/磁珠结合效率的5-10倍。这里同样要考虑竞争肽的竞争效率。如果只是普通贴壁细胞的一般水平的话，经过这么多步骤纯化，相信无法获得大量目标蛋白。依然建议直接换用大肠杆菌/昆虫/哺乳细胞表达体系会更有效。

zxb597

2022-01-17

有帮助

加入高浓度的甘油、加人稳定性基质, 甚至加入其他蛋白质有利于蛋白质的长期稳定性，或者蛋白酶抑制剂。

Guoood

2022-01-17

有帮助

直接加SDS loading 煮沸洗脱方法效率确实是最高，但同时也会使抗体分解出重轻链，也会影响下游实验的进行。我用的是酸性洗脱法，用50-60ul pH2.8的tris-gly 溶液孵育5min，洗脱后加5ul ph8.8 tris中和即可用于后续实验。至于竞争性多肽洗脱还没试过，标签抗体目前比较成熟，参考竞争性多肽说明书用量估计效果不会差，希望对你有用。