内参GADPH出现弥散，并且有两条条带是为什么？
丁香实验
之前一批蛋白不会出现这种情况。这批蛋白刚提出来跑GADPH的时候是正常的，但是第二次之后就一直是弥散状态的内参，有时候还会出现两条条带（如下图），求助大家，这到底是什么原因啊 
29 个回答
是小杨同学
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我觉得可能是你的蛋白降解了，然后出现了两条带，最好用新鲜的蛋白来跑胶呢
lzy必有我师
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1..你提取的蛋白质是否进行了分装，怀疑蛋白质有一定程度降解。 2还有可能是一抗不是很特异。 3.还有确定下配制的胶是不是正常的。4换个内参试试确定下是不是这个内参出现问题了。
dxyhsx123
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主要问题应该是胶没有配好，浓缩胶换个其他实验室的配方，还有就是电泳时候，缓冲液浓度和电压不要过大。
内科小护士
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如果都这样那就是实验条件或者试剂抗体的问题了，都有可能会引起弥散的条带。
dxy_pggo2lp2
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1.检查抗体的纯度，看是不是抗体的纯度不够
2.检查封闭的时间和温度。我一般封闭5% BSA in TBST ，1.5h，T.M.
3.在敷一抗的时候，新配置5%BSA TBST，不要用封闭液。
4.如果第一次的正常的，那就要考虑是不是蛋白的保存出问题了。一般冻融一次是不会出现蛋白质降解的。可以考虑在操作时候的温度是不是4℃，电泳液是不是新配置的，变性时的温度是不是100℃。
JCorona
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1.如果缓冲液是用Tris-HCl制备的， 那么离子强度会很高，导致积层（浓缩）胶压胶效果差，可能导致出现弥散的条带；2.样品中高浓度的盐可能导致条带失真，可用透析、沉淀等方法降低样品的含盐量；3.电压太高，积层效果不好
医往情深丁香园
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一般这种情况就是蛋白降解了，以后最好分装，然后每次用完的就不要用第二次了，或者加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
dxy_qkedgrg7
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第一次是正常的第二次就不行了可能是反复冻融的原因，一般提取蛋白后最好分装一下放在-80，或者提前把所有蛋白都变性后再保存
vae1476
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用什么封闭的呢？可以延长时间，试一下冰箱封闭过夜
ZZDX-YILILI
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1.首先换个内参试试确定下是不是这个内参出现问题了。
2.你提取的蛋白质是否进行了分装，怀疑蛋白质有一定程度降解。
3.还有可能是一抗不是很特异。
4.还有确定下配制的胶是不是正常的。
dxy_bq4uxnd
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这种情况可能是反复冻融过程中，蛋白发生了降解，GAPDH蛋白发生降解，所以出现多条带。
一支肾上腺素
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其实一开始怀疑胶的问题，既然可能不是ph的问题的话，就看看你的loading buffer吧，有时候loading用久了，放在室温久了也会比较弥散的。其实个人认为，弥散这个问题不是很大。一般不会影响蛋白。如果要解决，可以选择重配buffer。
小暮
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一般考虑是loading buffer的问题，是不是配置太久坏了？
dxy_h7vcp8v3
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可能是蛋白放置太久，发生降解。所以，会出现两天带。建议容易降解的蛋白，新鲜制备新鲜跑胶进行实验。
dxywode
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这些丢失的不可溶组分覆盖了整个蛋白质图谱分子量范围，不同样品的不可溶组分也有细节上的差异。不同样品的蛋白质丢失是不可预测的。然而，离心管柱法提取蛋白不产生不可溶组分，更快速，可获得更高产量更完整的蛋白质图谱。
dxy_pni5ki46
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如果第一次没问题第二次出现两条带不知道是不是冻融之后蛋白降解造成的
dxy_w4oj7yoe
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看样子像是降解带，注意一下样品保存问题，样品可以液氮速冻保存到-80℃，煮样时间也不要过长。可以再做一次试试，也有可能是偶然情况，下次再做没这种问题就行了
dxy_4uyyu09r
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不知道你有没有拿之前正常的样品做对照，如果还是这样应该是样品保存出了问题，建议重新收样品吧。如果都这样那就是实验条件或者试剂抗体的问题了，都有可能会引起弥散的条带。
jey1235
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如果同批样品，有好有坏，抗体是否换过或者保存是否不佳，都没有的话，看图应该是样品发生了降解。其实制好的样也要放在4度或者-20保存。
还有一种可能就是简单的一抗效价下降的太厉害了，建议妥善保存。
小白野蛮成长
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先换抗体试试 不行的话重新提蛋白
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