免疫印迹中显色问题

相关实验：蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)

丁香实验

2022-01-12

免疫印迹最后用显色液显色的时候，抗体的大小亚基也会被显色出来嘛，原因和解决方法是什么呢？

29 个回答

是小杨同学

2022-01-20

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一般来说抗体的大小亚基是不会显色出来的吧，可以降低一下抗体的浓度试试

dxyhsx123

2022-01-20

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做WB的时候，抗体的大小亚基不会被显色区分开来的。问题描述需要更具体。

dxy_9kptsiw

2022-01-19

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抗体信息一般会说明抗体使用的蛋白位点。如果报告，一般是可以都显出来的。如果只针对某一位点，最好多查询几家抗体，详看抗体信息。

lzy必有我师

2022-01-19

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1)目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。 2)目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。 3)样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。 4)上样量过高，太敏感——适当减少上样量。 @南京德泰生物 5)一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。 6)一抗不纯——纯化抗体 7)一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。

医往情深丁香园

2022-01-19

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抗体能够和目的蛋白的大小亚基都能结合，最后会染色出来两条带，只要大小正确就没问题

dxy_bq4uxnd

2022-01-19

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如果只是做了western blot 抗体的大小亚基是很难被显出来的，如果显出来了，那就要考虑操作问题了，尽量规范操作，降低抗体比例，问题应该可以解决。

JCorona

2022-01-18

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没太看懂问题，通常免疫印迹使用的抗体标记物都是HRP，结合在抗体的Fc段。而抗体结合抗原的部位是重链的Fab段和轻链共同形成的结构。如果你说的抗体的大小亚基是指重轻链，那么应该是不会显现的，因为二者分离后通常不再具有免疫性。

一支肾上腺素

2022-01-18

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是这个亚基上的抗体上的酶与底物反应发出的荧光，但是蛋白分子太小了。

内科小护士

2022-01-18

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一般来说不会被显色出来，建议遵循生产商的进行稀释或确定最佳抗体浓度。

小白野蛮成长

2022-01-18

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换特异性强的抗体减少上样量试试

dxy_rlratyf3

2022-01-18

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一般显色都显不出来蛋白的亚基呀，你是说你显色的时候看到所谓“大小亚基”了吗？那可能是蛋白被蛋白酶降解了。显色的原理是固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

dxy_h7vcp8v3

2022-01-18

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可能抗体浓度过高，建议按抗体说明书浓度稀释倍数对抗体进行稀释使用。其次，显示出来的条带可能是别的杂蛋白条带，因为抗体不是理想中的特别专一，会识别杂蛋白条带。例如his抗体就可以识别除了his标签以外的蛋白条带。建议，吧目的蛋白纯化至纯度足够高，在继续实验，看后续结果。

ZZDX-YILILI

2022-01-18

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1.二抗中有多聚体，建议过滤下二抗去除多聚体或者更好二抗试试。 2.一抗特异性不好或者一抗不稳定，导致最终二抗与其集合显示多条条带。

dxywode

2022-01-18

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zxb597

2022-01-18

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将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况

于小闹0808

2022-01-18

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严格来说，是这个亚基上的抗体上的酶与底物反应发出的荧光，但是蛋白分子太小了，一个亚基上的抗体发光与整个蛋白发光在人眼的分辨条件下无法分辨，所以感觉是整个条带在发光。

jey1235

2022-01-18

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一般不会出现这种问题，一抗抗是和目标蛋白结合，二抗和一抗结合再利用ECL发光呈现最终条带。基本不会大小亚基这种情况，如果有多条带，有可能是抗体特异性不好，有可能是目标蛋白有多isoform，主要依据抗体制备的抗原片段是否特异。可以选用不同抗原片段来源的抗体，二抗一般不会出问题。或者换一下不同样品来源。