实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问利用WB检测asc寡聚化

dxywode

一般做蛋白的寡聚化，用交联的方法，可以分为In vivo 和in vitro两种情况。in vivo：用Cross－linker（such as DTSSP)处理细胞一定时间，如果你的蛋白是寡聚体形式存在，它可以把你的四聚体交联在一起，那么用不含DTT的裂解液收集细胞，然后跑胶，western，你可以看到在分子量4倍的地方有条带，设好各种对照，你可以判断出那是不是你的四聚体形式。这里就讲个原理，具

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问表达蛋白的时候总是会出现内涵体，怎么避免这种情况呢？

小布丁瑶瑶

可以使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化培养基条件，进行融合表达，可以避免出现内涵体。

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问ELISA实验相关问题

dxy_gwrp7ndq

一般室温24h，但4度过夜确实是最好的，另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握井获得较好的效果

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问重症肌无力大鼠实验的神经肌肉接头怎么定位

dxy_gwrp7ndq

α-银环蛇毒素(α-Bungarotoxin简称α-BT)与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase简称HRP)结合物,对肌肉神经接头处N-乙酰胆碱受体的电镜定位方法

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问为什么染色质免疫共沉淀的时候，抗体加多了反而免疫效率低了？

府宅

抗体过多，会使假阳性信号增多，影响免疫效率

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问如何进行肿瘤组织免疫浸润分析？

dxy_gwrp7ndq

分析要点免疫基因集富集情况的比较免疫细胞评分比较免疫细胞类型在不同分组中对预后的影响免疫调节剂基因表达比较重要免疫特征分布分组比较

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问肿瘤相关巨噬细胞表面标志物都有哪些？活化的肿瘤相关巨噬细胞，要看哪种标志物？

dxy_gwrp7ndq

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问wb如何才能把内参蛋白条带跑直？

dxy_gwrp7ndq

1.分离好蛋白上清，在加Loading buffer，ddH2O前药先把金属浴仪器打开，使其尽快达到预定温度。然后快速于每个蛋白样品中加入LB和水。这样可防止蛋白的继续降解。2.蛋白上样时，样品要混匀，特别是做CO-IP实验蛋白样品中含珠子的一定要充分混匀3.药物或其他外界因素：使用影响围观蛋白的药物作用细胞，如长春新碱、紫杉醇等不要用tubulin蛋白；在做缺氧相关实验时不要用GAPDH；有些药

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问动物组织的切片做免疫荧光出现严重的非特异性染色的原因是什么？

府宅

原因：1.抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。2.荧光素不纯，标本固定不当等。

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问elisa实验有哪些步骤需要特别注意的呢？

dxy_gwrp7ndq

1.要注意在包被时：①板孔的选择：ELISA级别的微孔板②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。2、注意在封闭时：①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性

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问为什么wb跑的条带好几条都是波浪装？分子量47 上样量30ug

府宅

1、上样体积过大可以导致，设法减少体积（提取蛋白同样条件下减少裂解液）。2、胶配的有问题，“越靠近下部越明显”说明你的胶不好。如果你在收胶的时候仔细看（把玻璃板表面去离子水洗干净）会发现下部有波浪状，即胶凝的不够均匀，自然会出现波浪状条带了

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问chip-seq实验相关问题

dxy_gwrp7ndq

ChIP实验中的抗体对于特异性、亲和力、效价都具有较高要求，能够成功用于WB、IHC等实验的抗体并不确保能成功运用于ChIP，因此需要选用经过ChIP验证的商品化抗体，这类抗体常会标明ChIP grade。关于单抗和多抗。单抗具有特异性优势，但风险在于其识别表位可能恰好被掩蔽（DNA或交联环节），而多抗可识别多个表位可基本避免该风险。因此单多抗各有优缺点，应重点关注该抗体是否经过ChIP验证。

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问宫颈上皮内瘤变CIN2，免疫组化p16、ki67(-)应该诊断为？

dxy_gwrp7ndq

P16和Ki67的阳性程度，判定方法是这两者阳性占宫颈上皮的多少，如果P16和Ki67阳性都超过鳞状上皮2/3层，那么就是高级别病变，若是两者只是阳性不超过1/3就是低级别，要是都是基底阳性就是正常的。宫颈上皮内瘤变CIN2，免疫组化p16、ki67(-)，就可以诊断为低级别宫颈上皮内瘤变

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问请问如何更好的封闭非特异性蛋白？但是对目标蛋白没有影响。跑出来的条带总是有杂带或者背景不干净，除了封闭，还应该优化哪些步骤？

府宅

Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。上样量过高，太敏感——适当减少上样量。一抗特

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问ELISA显色失败都有什么原因？

dxy_gwrp7ndq

失败原因：1.包被原：包括你的包被液有无问题，有没有配错。包被原一般加100微升，37度2小时； 2.封闭：封闭液用的是否适合？你说做了几次都没显色，空白孔也不显吗？如果空白也无颜色，那封闭就没有问题。一般封闭是200微升每孔，也可以满孔封闭 3.一抗：检查你的一抗是否失效。是否是在37度反应 4.二抗：底物，底物缓冲液……这些都要好好检查！ 5.洗涤：用PBST洗涤，包被和封

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问求教大家一个问题瓶口刻度

师医生说

在实验过程中，注意容量瓶的选择是很重要的，要根据自己液体容积的多少，采用微量加样器或者是量桶。眼睛要平齐液体凹液面，同时，要避免在光线不良的情况和有折射的环境中进行。实验员有同伴的情况，最好是取平均值更为准确

2 回答226 围观

问免疫组化，切片出现断裂，是什么原因呢？

小布丁瑶瑶

透明时间过久容易导致断裂，可根据组织透明情况来使用二甲苯透明，另外试剂还是需要定期更换的

3 回答892 围观

问问:标本流水冲洗可以超过24h吗？

师医生说

标本的流水冲洗在染色步骤中至关重要，要尽可能的控制水压和注意评估流水的酸碱度，在保证，均匀的流出情况下，有很好的分化和反蓝作用，是可以适当延长时间的

4 回答397 围观

问小鼠肝细胞PCR怎么测？

彭文彬

可取米粒大小肝脏，提rnd逆转录！

3 回答326 围观

问基础实验的结果和临床观察不一致，容易发文章吗？

陈文豪平邑

不容易，临床医生在临床试验的设计和实施过程中扮演重要角色，同时，临床医生、临床试验方法学家、临床试验管理专业人员通力合作，才能确保临床试验的高质量设计、实施、分析和报告。

9 回答691 围观

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