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问
为什么冰冻切片不可以用甲醛固定
dxy_gwrp7ndq
如果用多聚甲醛或者是甲醛进行固定的话,组织速冻的过程中会产生冰晶,不利于组织的切片,并且影响片子的质量
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问
SDS-PAGE电泳实验相关问题?
府宅
1.缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。2.避免加样过多,提高分辨率。小体积样品可给出窄带,加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15uL(即2-10ug蛋白质)。3.加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳,不要久放,因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开,但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键,而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠,更不要扔到冰箱里保存。
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问
如何才能提高上机细胞的活率
府宅
磁珠分选效率会低一点,但细胞活性高。FACS分选的话要加双抗,注意无菌,分选的液体里面可以加血清湿润管子。
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问
RNA干扰技术温度如何控制?
Kimser
在PCR仪上进行两步扩增反应:94℃和72℃。 PCR产物的纯化是4℃。
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问
纯化好的蛋白怎么才能保持时间久一点?
府宅
短期保存(1周内):对于短期保存,大多数蛋白可以保存在4 摄氏度下。4摄氏度下保存面临最大的问题是微生物的污染。因此,如果保存时间超过24小时,建议利用0.22 um的滤膜过滤样品,除菌后保存在无菌的管子中。值得注意的是,并不是所有的蛋白质都适合保存在4度下。长期保存:对于长期保存,冷冻是必须的。蛋白质溶液在速冻后可以在-20度或-80度中进行,-80度下的蛋白可以保存更长久。长期保存蛋白质的另一
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问
ELISA实验如何尽量避免假阴性和假阳性?
dxy_gwrp7ndq
引起 ELISA 测定错误结果的原因主要有:①标本因素(类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠 Ig (s) 抗体、交叉反应物质和其它物质等干扰)②试剂因素(标本管中添加物质的影响)③操作因素(标本溶血、标本受细菌污染、标本凝集不全、标本保存不当)
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问
细胞转染si-RNA时,培养基加双抗会影响沉默效果吗?
府宅
大多数不可以添加,因为增加了细胞通透性,抗生素的进入会增加细胞的死亡,但Qiagen的hyperfect系列可以
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问
结果背景颜色过深是因为什么原因呢?哪些步骤需要注意呢?
菲菲飞呀飞
1)考虑一抗浓度高;2)然后调整DAB孵育时间;3)也要考虑血清封闭时间是否过短;4)适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。
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问
孵一抗的量是按组织面积还是体积计算?大概量为多少比较合适?
dxy_61kek75
按照面积计算,且在可以染出目的抗体的基础上尽量减少抗体浓度以减少由于边缘效应造成的组织边缘非特异性染色以及背景颜色非常强(也可以节省抗体),抗体稀释液可以覆盖组织一即可,不过,最主要的是防止染色孵育的时候抗体液风干,导致背景以及非特异性染色增强
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问
蛋白质定量实验的注意事项有哪些?
Kimser
说一个才被老师说的事情,因为封闭时有点事情导致封闭时间过久,结果我的蛋白没有显色,,,本来以为问题不大,结果也不说啥都没有,但基本算是白做了。此外,一抗或者二抗的时间也需要安排好,最好是弄个定时器放旁边
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问
免疫组化结果如何判读?
菲菲飞呀飞
结果分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下,随机10个视野下计数阳性着色细胞;后者则是在光学显微镜下按染色程度(0分阴性着色,1分淡黄色,2分浅褐色,3分深褐色)和阳性范围(1分0-25%,2分26-50%,3分51-75%,4分76-100%)评分,最终分数相加。
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问
大家都怎么防止蛋白降解啊?
whilt-shirt
1、在样品制备过程中添加蛋白酶抑制剂;2、样本用液氮保存,超低温下蛋白降解慢。
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问
为什么WB显影后,有些位置没有条带,但内参上样量一致,重新转染后仍是没有,请问这是为什么,有什么解决办法吗?
小郭医生go
我的跑了都是质粒空载转染的没有出现目的条带,可能本身表达量就很低,或者你加大上样量试试看
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问
WB总是做不出理想的条带肿么破?
飞天幻雪
做不出理想的条带是什么意思呀?内参不齐?没有目的条带?杂带太多?还是做出的趋势和实验预期不符合??
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问
ELISA试剂在对不同实验的选择上,需要遵循什么样的标准?
Kimser
根据抗体类型选择:首先看是单抗还是多抗,又或者两者结合。顾名思义,多抗能够确保捕获所有抗原,随后单抗再特异性检测拥有特定抗原表位的抗原。所以,我们应该明确捕获抗体和检测抗体所识别的抗原表位不存在重叠。
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问
做WB有什么要注意的吗
66QB1H
1.选择合适的分离胶浓度2.选择合适的电压、电流3.选择合适的一抗和二抗,并注意一抗二抗浓度和孵育条件(时间、温度等)3.洗脱时注意时间,太长太短都有影响4.配胶和转膜过程都要防止气泡
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问
用dsRNA干扰后,应该根据什么选择检测干扰效果的实验呢?
小小袋袋
pcr测一测目标rna的表达情况,wb检测目标蛋白的表达情况,有改变后还可以考虑流式
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问
为什么遗传物质就是核酸?
今天摆烂了咩
RNA是单链的,结构不稳定,一旦变异就没有对应的修复机制,而DNA的双螺旋结构可以很稳定的存在,复制。
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问
在跑wb时同一个蛋白在不同组织或细胞中显示出不同的条带,有的一条有的两条,出现这种情况的原因是什么?
whilt-shirt
有可能是抗体对不同组织的特异性导致的
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问
求教RTPCR非特异性信号多的原因及解决办法?
whilt-shirt
1、引物为非特异性引物,优化扩增条件,可设置梯度Tm,摸索最佳的Tm值;2、引物浓度太高,适当降低引物浓度;3、可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体;4、模板有基因组污染,重新逆转录cDNA
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