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实验问答

31,559,327 科研人在看

问EMSA反应后条带弥散

whilt-shirt

检查探针上是不是有很多蛋白的BINDING SITE ？尝试减少曝光时间，EMSA 要在正常实验前要试一下不同BUFFER，高盐低盐等对结果的影响，建议从头摸索一下实验条件。另外考虑是不是跟胶聚合有关系。配胶的试剂是否新鲜，聚合是否充分。核酸电泳的时候，胶不好跑出来有时就会拖拖拉拉的。

3 回答3964 围观

问trizolRNA提取的具体步骤有哪些？

whilt-shirt

称取组织约50mg置于2mLEP管中，剪碎；加入Trizol试剂1mL，匀浆器研磨成浆，移入新的1.5mL EP管中，吹打混匀，室温静置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀，冰上静置5min，4℃ 15000g离心15min；吸取上层透明液体至新开启1.5mL EP管，加入500μL异丙醇，轻轻上下颠倒两次混匀，-20℃冰箱静置30min，4℃ 15000g离心15min；加入200μL 7

3 回答895 围观

问蛋白浓度较低，如何提高上样量

whilt-shirt

选用10孔的梳子，增加上样体积，提高总蛋白量

5 回答768 围观

问RNA提取后，跑电泳无条带是什么原因？

whilt-shirt

有可能是提取时样品量太大了，不要往RNA提取试剂里加太多液氮研磨的组织样品，因为一般来说RNA提取试剂一般加1ml ，这时如果加太多样品的话，1ml的RNA提取试剂抑制不了过多的样品中所含有的RNA酶，所以RNA在提取过程中就会降解。

4 回答2690 围观

问免疫组化两步法和三步法有什么优缺点呀？

dxy_gwrp7ndq

三步法是一般是最常用的免疫组化方法，敏感度高高的，操作上面也十分简便。如果组织内源性生物素过高，就容易造成了假阳性显色。内源性生物素在肝，肾组织中的含量尤其多，在脾、胰、脑、乳腺、子宫内膜和骨骼肌等组织中也广泛存在，因此，避开内源性生物素的感染，才最为关键。二步法利用多聚HRP代替了Bioten，这一招移花接木，从技术上克服了组织内源性生物素造成的非特异性的背景染色。二步法在避免了生物素干扰的同时

4 回答2167 围观

问蛋白质复性的时候，为什么加入尿素可以增加溶解度，但是尿素会使蛋白质变性，这是为什么呢？

dxy_gwrp7ndq

尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性,使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加天然蛋自质分子中的肽链以一定的方式盘绕曲折，形成特定的构象。这种构象的维持，主要依赖于蛋白质分子中的氢键。尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性。尿素对球状蛋白质变性作用有两点，一是降低蛋白质非极性基因与水的疏水作用，二是尿素对蛋白质酰胺、肽基团的亲和力增强，这两个因素使蛋白质处于一种

3 回答3816 围观

问WB封闭时，什么时候用脱脂牛奶，什么时候用BSA？

府宅

做磷酸化蛋白一般不用脱脂奶，因为脱脂奶中有磷酸化蛋白，会使背景加深。其他时候一般BSA和脱脂奶通用就好了根据经验来说，如果strip液洗过的，用脱脂奶感觉封闭的好一点

3 回答2768 围观

问SDS-PAGE电泳怎么区别loading buffer质量好坏？以及电泳的注意事项？

whilt-shirt

Loading buffer即常用的电泳上样缓冲液，工作浓度是1X 。Loading buffer中的还原剂如DTT、beta巯基乙醇可以打开蛋白的二硫键、使之解聚为亚基；还可与蛋白结合使之沉于孔底，易于电泳；同时还有指示作用。一般选用好的公司生产的Loding Buffer。电泳结束后，应及时冲洗电泳槽,以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀。清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝。

3 回答4300 围观

问转染后出现细胞死亡是什么原因造成的？怎么才能优化？

协和再爱我一次

转染试剂有毒性，加的量需要斟酌，最好问过师兄师姐。或者换用毒性更小的温和一点的转染试剂

3 回答1503 围观

问之前跑还有条带，重新跑PCR就没条带了，这是什么情况？求解答

刹那芳华2333

检查一下是否是pcr的体系或者反应条件的问题，或者样品存在污染，琼脂糖的浓度或者eb浓度是否有问题

3 回答1808 围观

问WB最后显影的结果有非特异性条带，而且比目标条带颜色更深，怎么解决？

whilt-shirt

可以换用NC膜，减少蛋白吸附，降低背景；封闭时间可以延长，过夜；一抗时间缩短，室温2个小时即可；降低上样量和加大一抗稀释度；延长冲洗时间和次数。如果没有好的BSA就换为牛奶封闭试一下，效果可能好一点。

3 回答732 围观

问免疫荧光为什么单标红色出来的是粉红色

丁香粉猪猪

标本固体色调制不对，可能显微镜或者固体液不对，调试一下

4 回答1011 围观

问蛋白质纯化实验相关问题

菲菲飞呀飞

1、在进行一个蛋白纯化之前，应该对其蛋白有所研究，包括其性质，敏感性，例如该蛋白的溶解性，对高盐或pH敏感，是否容易氧化等； 2、需要考虑蛋白质的用途，来决定制备蛋白的量级规模，这就要考虑到层析柱的尺寸，得到的蛋白浓度如何，是否需要保持其活性以及避免不必要的污染物；

3 回答960 围观

问出现干片的情况还可以复原吗？有什么方法补救？在实验过程中哪些步骤容易导致干片？

dxyv9281

组织过于干燥会出现干片，可以延长浸泡次数和时间

2 回答1545 围观

问组织切片脱蜡水化时使用的乙醇梯度设置几个比较好？时长控制在多长时间？是越长越好吗？

whilt-shirt

1)水洗后组织于5ml离心管内2) 75%乙醇脱水1 h-2 h或过夜（此步骤可根据实验时间安排选择是否过夜)3)80%乙醇脱水1 h-2 h4)90%乙醇脱水1 h5)95%乙醇脱水0.5 h或者过夜(此步可过夜组织仅限于肝，脑，肌肉等含水量多的组织)6)无水乙醇脱水20 min两次(依据含水量多少，脱水20-60min)7)无水乙醇+二甲苯1:1 20min。(进行过渡，以防脱水不彻底)

4 回答3294 围观

问实验数据的收集和分析有没有好的软件推荐？

菲菲飞呀飞

1、Excel 为Excel微软办公套装软件的一个重要的组成部分，它可以进行各种数据的处理、统计分析和辅助决策操作，广泛地应用于管理、统计财经、金融等众多领域。 2、SAS SAS由美国NORTH CAROLINA州立大学1966年开发的统计分析软件。SAS把数据存取、管理、分析和展现有机地融为一体。SAS提供了从基本统计数的计算到各种试验设计的方差分析，相关回归分析以及多变数分析的多种统计分析过

3 回答987 围观

问RNA的电泳检测问题

府宅

跑15%的胶时电压换为120V或者更高就可以了。

3 回答1812 围观

问单细胞测序怎么样最大程度的减少误差呢？要从哪里方面做呢？

whilt-shirt

样本准备原则（1）建议使用宽枪头重悬，以减少对细胞的损伤；（2）每次移液前先混匀细胞悬液，然后从管中部吸取；（3）所有环节都最好在无菌环节下操作、使用无核酸酶的试剂、减少移液步骤以及当可能损伤细胞的时候尽量使用宽枪头等。此外，可用一次性转液管去除离心后的上清液，以减少细胞沉淀的干扰；（4）取样的时候最好设置两个重复，对每个样品计数 2 次，即共计 4 次计数；（5）弃上清时候注意不要破坏细胞沉淀；

1 回答1133 围观

问在做DNA印记之前需要哪些试剂来处理genomic DNA?

whilt-shirt

1 酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸12Mol/L稀释 2 碱变性液,0.5mol/L NaOH，1.5mol/l NaCl pH13.1 3 中和液，0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl 4 20×SSC: 0.3mol/柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0 5 10×SSC和2×SSC 用双蒸馏水稀释20×SSC储存液

4 回答1065 围观

问临床手术取到的肿瘤组织如何保存使得RNA最不容易降解？同时也能提蛋白？

协和再爱我一次

要么超低温冻存要么加好Trozol研磨后冻于-80，用于后期提取RNA直接加裂解液研磨后冻于-40以下冷冻，用于后期提蛋白以上均不可反复冻融

3 回答556 围观

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