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RNA提取相关的问题
whilt-shirt
1.一定要注意冰上操作,低温离心。2.戴口罩和勤换手套,去任何东西都要带着手套去取。3.每次去器材的时候都要用镊子去夹,镊子要在酒精灯上烧一下。4.所有的器材都要经过 DEPC 浸泡后高压后才可以使用,所需要的氯仿,酒精, 异丙醇等都保证没有被 RNA 酶污染,不能用没有泡过 DEPC 的枪头去提取液体。
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问
提取DNA前处理有磁珠,一般会是哪里的原因?
丁香粉猪猪
可能跟磁珠的词性跟或者磁吸的时间有关
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问
小片段RNA干扰致基因表达沉默的具体步骤有哪些?
Kimser
1,制备sirna,有化学合成法和转录法,其中还涉及shrna和Ago蛋白2,转染宿主细胞3,检测靶基因是否沉默
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问
跑出来的杂带太多了,还有脱尾存在,杂质怎么去除?这么多去杂质的溶剂,放的先后顺序是什么?
whilt-shirt
要先确定实验过程中的所有操作步骤都是正确的,这样才能找到问题所在,杂带有可能是抗体浓度太高或者敷育时间过长都会导致杂带,或者更换封闭液可能会减少杂带
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问
加入考马斯蓝试剂后需要在多长时间内测完?样品太多,放置时长太长会不会有影响?
Kimser
2分钟内就可以和蛋白质结合,能稳定存在1h。放置时间没有确切时间,不过要4℃保存,再用记得复温
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问
结果出现了非特异性着色的问题,是实验的哪一步出了问题,需要怎么改进?
菲菲飞呀飞
1.非特异性组分与抗体结合,这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果2.缩短 DAB 孵育时间或降低 DAB 浓度/过氧化氢浓度等;3.适当增加 PBS 冲洗次数和浸洗时间,在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤为重要;4.防止标本染色过程中出现干片,这容易增强非特异性着色
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问
DAB-H2O2 显色的时间过长了,显示的结果不太好,有什么补救方法吗?
煤球儿啊
重做一次比较好,新片子重做比较好
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问
动物组织如何提取高纯度rna
丁香粉猪猪
RNA是以核蛋白复合体的形式存在,所以在提取动物RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂,迅速破坏细胞结构,使核蛋白与RNA分离,释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心,使RNA与其他细胞组分分离,得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性,保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂,如DEPC是RNase的强抑制剂,常用来抑
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问
在免疫组化制片的时候有什么办法能让组织完整无刀痕?脑组织切片厚度多少才是最佳的?
菲菲飞呀飞
想要免疫组化制片的时候让组织完整无刀痕,必须保持切片刀锐利,切片要薄而平整、无皱摺、无刀痕,如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象,切片厚度一般为3~4μm,切好的切片在60℃温箱中过夜,注意烤片的温度不宜过高,否则易使组织细胞结构破坏,而产生抗原标记定位弥漫现象
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问
蛋白质测序结果多次失败,怎么提高实验的成功率?
whilt-shirt
在目前条件下,质谱很难100%给出肽段的序列,经常会丢失一些肽段,蛋白质磷酸化修饰也会抑制胰蛋白酶的酶解,并且磷酸化肽的含量较非磷酸化肽段的含量少很多,质谱对质谱分析仪磷酸化肽的响应就可能会被抑制。因此,要尽可能把非磷酸化肽段的含量降到。减少非磷酸化肽的方法有分馏、IMAC(固相化金属亲和色谱)和抗体结合。通过MALDI-TOF-MS测定肽段的分子量,根据所得肽段分子量比预计的分子量大80Da或其
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问
预防蛋白质样本变性方面有什么需要注意的地方?
whilt-shirt
环境可以影响蛋白质,如温度、重力等因素都会使蛋白质变性,保持低温和适当的酸碱度,给其温和环境
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问
何为黏附分子????
青柠清心
粘附分子根据结构特点分为整合素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家族、钙粘蛋白家族,此外还有一些尚未归类的粘附分子。功能:⑴参与免疫细胞的免疫发育与分化。如胸腺细胞发育成熟过程中涉及到胸腺细胞上CD8和CD4分子与胸腺基质细胞上的MHCⅠ、Ⅱ类抗原间的相互作用;T细胞活化分化过程中必须有粘附分子提供的细胞间协同刺激信号的存在。⑵通过白细胞与血管内皮细胞上的粘附分子之间的作用参与炎症过程 ⑶通过淋巴细胞
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问
新手想做这个试验,大概要花费多少时间成本跟金钱成本呢?
煤球儿啊
新手啥都不会的话,需要摸索的东西就比较多,费时费力
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问
coip后的结果,怎么判断我的目标蛋白和ip得到的蛋白一定有相互作用呢?
刹那芳华2333
免疫共沉淀(Co-IP)是利用抗原与抗体之间的专一性作用为基础,用于研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的经典方法。利用免疫共沉淀可以检测两个已知蛋白之间的相互作用,或者利用已知蛋白寻找与之相互作用的未知蛋白,通过wb的阳性条带来判断是否发生互作
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问
转染效率问题!!!
dxyv9281
应该先做REALtimePCR检测一下,如果确定低了,然后再做蛋白水平的检测
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问
小鼠干细胞怎么培养?
丁香粉猪猪
一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板(使用或不使用盖玻片)体外分化方法注:以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系,其它胚胎干细胞的培养可以参考。
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问
新手小白第一次如何设计siRNA、shRNa相关序列?
bamboopiggy
第一次,最好是按照参考文献来,你做的rna一般应该有人做过。如果实在没有,有在线的si和sh的设计软件可以用,thermo官网上就有
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问
含脂肪较多的样品如何提高RNA质量?
guoyanli0000
氯仿反复抽提,离心后分离可得到高RNA质量
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问
出现蛋白没有活性什么原因?
dxyjonas
蛋白质在抽提时,许多试剂都会改变蛋白质的空间结构,如二太多键的断裂,些金属离子的析出,以及各种次级键的重新组合都会影响蛋白质的功能。
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问
RNA跟DNA的区别?
菲菲飞呀飞
RNA又称核糖核酸,一个核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和碱基构成,RNA的碱基主要有4种为腺嘌呤,鸟嘌呤,咆嘧啶,尿嘧啶,RNA是以DNA的一条链为模板,以碱基互补配对原则,转录而形成一条单链,它的主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达。DNA又称脱氧核糖核酸,它的主要功能是长期性的信息储存,DNA的复制方式为随机半保留复制。
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