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操作演示

解锁样本制备

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1. 组织解离常用方法组织解离主要依赖酶解法和机械分离法，或将两者结合以达到最佳效果（1）酶解法（Enzymatic Digestion）利用特异性蛋白酶水解构成组织结构的细胞外基质（ECM）和细胞间的连接蛋白，从而将细胞从组织微环境中释放出来。这是目前最主流且高效的解离方法。为防止死亡细胞释放的 DNA 导致细胞聚集，消化液中通常会添加 DNase I。（2）机械分离法 (Mechanical Dissociation)通过物理手段，如精细剪切、温和研磨、移液器吹打或自动化仪器震荡，破坏组织结构，分散细胞。此方法常用于结构松散的组织（如脾脏、淋巴结），或作为酶解法的辅助手段以增强解离效率。（3）联合应用策略大多数成熟的方案都采用「温和机械处理 + 高效酶解」的组合策略。首先通过机械方法将组织切成小块以增加酶作用的表面积，再进行酶解消化，最后通过轻柔的机械力辅助细胞的分散。这种策略旨在解离效率与细胞损伤之间取得最佳平衡。市面上已有成熟的自动化组织解离平台例如 gentleMACS 采用此种解离策略，极大地提升了效率，确保了结果的高活性、高得率和高重复性。（4）常用消化酶及其作用（5）主

1. 解离前取样、运输、储存注意事项组织解离成功与否很大程度上取决于样本质量。不同的来源、取样方式、运输和储存条件可能会得到有明显差异的解离效果。一般建议取新鲜组织样本，取样过程尽量快速操作，避开坏死区域，低温保存在适宜的溶液中或短暂时间内进行解离实验，以保证足够好的细胞状态。对于一些重要组织，当不能取样后立即进行下游解离时，需要将组织暂时储存，避免细胞坏死和凋亡，并防止细胞激活和细胞多能性的变化，以保持细胞的正常生理功能状态。常见的方法是冻存组织样本，但是在解冻后常常会导致大量细胞死亡，并且运输难度大。对于这些考虑，组织保存液MACS组织保存液（130-100-008）可以使新鲜固体组织在2-8 ℃ 保存 48 小时并避免细胞激活和凋亡等背景效应。2. Buffer配制对酶活的影响？在组织解离过程中，缓冲液（Buffer）的配制对酶活性有着至关重要的影响。配制不当的缓冲液会显著降低酶活，导致解离效率低下、细胞损伤增加或解离失败。常见影响酶活性的关键因素：pH值，离子种类与强度，渗透压，温度，其他添加剂等。按照说明书需要精心配制buffer，确保其维持最佳的pH、离子环境、渗透压，并提

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操作演示——解离成年小鼠脑组织用于单细胞测序研究

组织获取——样本制备——磁分选——下游应用

1、质粒的概念质粒（Plasmid）是一种存在于细菌、酵母等微生物细胞中的小型环状双链 DNA 分子，能够独立于宿主染色体进行自我复制，并通常携带对宿主生存非必需但具有特定功能的基因（如抗生素抗性基因）。质粒是分子生物学和基因工程中最重要的工具之一。 质粒根据其用途可以分为多种不同的类型，如用于保存序列信息的克隆质粒（如：pUC 系列质粒），用于表达蛋白的质粒（如哺乳动物细胞表达所用的 pcDNA3.1 系列质粒），用于基因编辑的质粒（如哺乳动物细胞基因编辑所用的 espCas9-2A-GFP 等）以及其他应用的质粒。根据质粒的拷贝数不同，又可以分为高拷贝质粒（质粒可以在细胞内复制成几百个拷贝）和低拷贝质粒（质粒在细胞内只有＜20 个拷贝）。质粒的拷贝数通常受到复制子的调控。质粒上通常会带有多种元件，例如，复制起始位点（ORI），抗性基因，多克隆位点，启动子，终止子，标签序列等等。质粒上至少要带有复制位点（ORI），否则无法进行复制；除了一些特殊质粒（如 minicircle plasmid）之外，绝大多数质粒都带有抗性基因，用于抗生素筛选。多克隆位点可以通过酶切，酶连或者同源重组插入

内容概括：1）质粒提取的量不足；2）质粒纯度低；3）Nanodrop检测值虚高；4）质粒超螺旋比例太低；5）质粒酶切切不开或者有杂带；6）质粒转染细胞效率低；

内容概括：1）质粒抽提的原理；2）质粒抽提--细菌培养；3）质粒抽提--裂解；4）质粒抽提--纯化；5）质粒抽提--质量检测；

内容概括：1）质粒的基础知识；2）质粒载体的构建流程；3）片段重组的构建方案；4）质粒载体构建的常见问题分析

1. Qubit 定量与紫外分光光度计定量的区别在常规实验室对核酸定量的检测中，常会用到紫外分光光度计（或 Nanodrop）和 Qubit 两种检测方法，二者在原理、准确性、操作难易等方面存在显著差异。①首先两者原理不同，紫外分光光度计基于核酸的紫外吸收特性来实现对核酸的定量：核酸（DNA/RNA）在 260nm 波长处有特异性吸收峰，且吸光度与核酸浓度成正比；Qubit 基于荧光染料与核酸特异性结合的原理来实现对核酸的定量，两者结合后荧光强度与核酸浓度成正比，通过标准曲线校准实现定量；②Qubit 准确度更高：蛋白质、游离核苷酸、EDTA 等物质在 260nm 处也存在吸收峰，从而影响紫外分光光度计定量的准确度，而荧光染料仅与目标核酸特异性结合，不受其他杂质影响，qubit 成为精准定量的 「金标准」；③Qubit 检测范围更精准：紫外分光光度计检测范围较宽（通常 ng/μL-μg/μL），但低浓度（<10ng/μL）时误差显著，Qubit 可检测 pg/μL-μg/μL 范围的核酸，低浓度下灵敏度远高于紫外法；④紫外分光光度计操作更简单，成本更低：紫外分光光度计可以直接点样

1. 如何选择合适的限制酶切位点？在载体构建实验过程中，限制性酶切位点的选择是决定克隆成功率和后续实是否顺利的关键步骤。选择时需综合考虑载体特性、目的基因序列、酶的反应特性及实验需求，我们可以从以下几个角度分析：①确保酶切位点在载体和目的基因上均存在且唯一：这是选择的基本要求，避免载体被切成多个片段；②通过双酶切实现 「定向克隆」，避免反向连接：单酶切可能会导致目的基反向插入载体（该情况会导致表达失败），因此建议优先选择两种不同的限制酶进行双酶切，利用其产生的不同粘性末端（或平末端）实现定向克隆；③考虑酶的反应条件兼容性：双酶切时，需确保两种酶的反应条件（缓冲液体系、温度、是否有星号活性）是否兼容，从而提高酶切效率；④需要保证目的基因的阅读框和功能完整：比如构建表达载体时需要通过酶切位点的选择来确保起始密码子与启动子正确衔接与阅读框正确，eg：目的基因的 ATG 需位于载体启动子的下游，且距离合适（通常间隔几个碱基，避免过远影响翻译起始），酶切位点引入的额外碱基需不改变目的基因的阅读框（3 的倍数），否则会导致移码突变，表达错误蛋白。2. 目的片段太大 (>10kb) 克隆困难怎

1. 琼脂糖凝胶电泳检测质粒为何有三条条带通常完整的质粒电泳会看到多个电泳条带，这与质粒的多种形态有关。质粒可以有超螺旋，线性，开环等多种不同的形态，所以在电泳时常看到三条不同大小的条带，而最下面最亮的条带一般为超螺旋条带。左图为电镜下的质粒形态，可以看到质粒有不同程度的超螺旋形态；右图为质粒电泳图2. 质粒纯度不好质粒中常见的污染杂质有蛋白质、基因组 DNA、RNA、乙醇等。这些杂质有可能是质粒提取过程中操作不当有关，比如：①在加入裂解缓冲液后，剧烈震荡导致大肠杆菌基因组 DNA 断裂，进而造成基因组 DNA 残留，此时应按照说明书轻柔翻转操作；②加入中和缓冲液后，剧烈振荡会造成质粒 DNA 与蛋白交联；③漂洗时乙醇没有通过离心或者干燥完全去除，从而影响下游的实验。此外避免内毒素残留是转染级以上的质粒需要严格控制的指标，使用 QIAGEN EndoFree Plasmid kit 系列提取质粒，可以把内毒素控制到 0.1EU/ug 以内，并且在操作过程中无需添加额外的操作步骤。3. Nanodrop 检测数据分析、检测浓度虚高Nanodrop 检测基本原理：盐类多糖及有机溶剂、蛋白、

1. 质粒载体构建不成功（目的片段和载体不能成功连接）的常见原因分析①DNA 片段纯度差：体系中的杂质会降低连接效率，如果使用不纯化直接连接的方法一直无法成功构建载体，可以考虑进行纯化后再进行连接；②目的片段和载体片段使用比例悬殊，或者用量过多或过少：目的片段和载体的摩尔比需要控制在一定范围之内，否则会影响连接效率，具体比例可以草靠连接酶说明书；③连接条件不当：比如连接时间不足、温度不合适、酶失活等，可以通过设置对照组来排查原因；④引物设计问题：比如通过无缝克隆的方式进行连接，同源臂区域如果 GC 含量过高过低，或者有重复序列，都可能在核酸外切酶切割后形成发卡结构，影响重组效率，可以使用质粒设计软件来检查同源重组臂的设计。⑤插入序列本身的问题：有些序列本身存在连接载体困难、连接产物不稳定、连接产物在大肠杆菌中复制困难等问题。对于这类序列可以考虑将序列打断后分步构建，或者更换载体或感受态的方式尝试解决。2. 质粒提取量不足质粒提取量少常见的原因可能是：①摇菌时间过长：大肠杆菌生长已经超过对数期，细菌老化，导致细胞和 DNA 降解。②摇菌时间不足：细菌生长不充分，不能得到足够的菌量来抽提质

高分辨率转录组和蛋白组的整合研究

单细胞和空间组学课题研究思路及案例分析

基于 FFPE 样本的时空多组学解决方案