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高分辨率转录组和蛋白组的整合研究

单细胞和空间组学课题研究思路及案例分析

基于 FFPE 样本的时空多组学解决方案

肿瘤治疗与耐药机制研究是肿瘤研究和临床实践中极为关键的领域，具有深刻的生物学意义与临床转化价值。肿瘤治疗的核心目标在于通过手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种手段协同干预，最大程度清除肿瘤细胞，以延长患者的生存期并提升生活质量。然而，耐药性的产生始终是制约治疗效果的关键瓶颈。耐药性可以分为先天耐药（治疗前已存在耐药克隆群）和获得性耐药（治疗过程中适应性演化形成的新耐药机制）两类，其分子机制具有高度异质性：包括驱动基因的新发突变或扩增、表观遗传修饰重塑、代偿性信号通路激活、药物外排泵（如 ABC 转运蛋白家族）表达上调、肿瘤细胞免疫原性降低导致的免疫逃逸，以及肿瘤微环境（如纤维化基质屏障、免疫抑制细胞浸润）的保护性作用等。耐药性的出现不仅直接削弱治疗应答，更可能成为肿瘤复发与远处转移的潜在驱动因素。因此，系统解析肿瘤耐药的演化轨迹与分子机制，开发基于联合用药的耐药逆转策略，发掘新型治疗靶点及疗效预测生物标志物，对于提升肿瘤治疗的精准度与持久性、改善患者预后具有不可替代的临床意义。接下来，我们将通过具体案例，阐述如何利用单细胞与空间组学技术解析肿瘤治疗及耐药相关的生物学问题。 案例一

肿瘤微环境（TumorMicroenvironment,TME）作为肿瘤发生、发展及转移的核心调控单元，具有深刻的生物学意义。其构成极为复杂，涵盖肿瘤细胞、免疫细胞（如 T 细胞、B 细胞、巨噬细胞等）、基质细胞（如成纤维细胞、内皮细胞等）、神经细胞，以及细胞外基质（ECM）和各类信号分子（包括细胞因子、趋化因子、生长因子等）。TME 不仅为肿瘤细胞提供物理支架，更通过精密的细胞间通讯（如配体-受体介导的信号传递）及复杂的信号网络，全方位调控肿瘤的生物学行为。例如，免疫细胞可被肿瘤细胞募集并发生表型极化，进而抑制抗肿瘤免疫应答；基质细胞则能通过分泌功能性因子或重塑 ECM 的理化特性，推动肿瘤的侵袭与转移进程。此外，TME 的空间拓扑结构（如三级淋巴结构的存在形式与定位）也对肿瘤免疫应答效率及患者预后具有显著影响。因此，系统解析肿瘤微环境的组成特征、功能分工及其与肿瘤细胞的动态互作机制，对于开发新型免疫治疗、靶向治疗策略以及精准预测治疗响应，均具有不可或缺的理论与临床价值。接下来，我们将通过具体案例，阐述如何利用单细胞与空间组学技术解析肿瘤微环境的相关生物学问题。案例一：单细胞技术联合

肿瘤转移作为肿瘤致死性的核心驱动因素，是恶性肿瘤最具特征性的生物学行为之一，其分子机制与临床意义极为复杂。这一过程呈现多步骤、动态级联的特征：起始于原发灶肿瘤细胞的侵袭脱离，随后通过侵入循环系统形成循环肿瘤细胞（CTCs），继而在远处器官完成定植、适应新微环境并最终形成转移灶。在此过程中，肿瘤细胞需连续突破多重生理与免疫屏障，包括跨血管壁穿透、逃避机体免疫监视及适应异质性的远端微环境等。转移潜能细胞通常具备更高的表型可塑性与环境适应能力，甚至可进入休眠状态以规避免疫攻击和治疗压力，部分病例中可在数年后续发激活，导致迟发性转移的发生。此外，肿瘤转移的复杂性还体现在与肿瘤微环境的动态互作中——微环境内的基质细胞、免疫细胞及信号分子构成的网络，既可促进转移进程，亦可通过特定机制抑制转移发生。因此，深入解析肿瘤转移的分子机制与调控网络，对于开发靶向转移关键环节的阻断策略、改善晚期肿瘤患者预后具有不可替代的理论与临床价值。接下来，我们将通过具体案例，阐述如何利用单细胞与空间组学技术解析肿瘤转移相关的生物学问题。 案例一：单细胞多组学揭示 IFN-γ协调软脑膜抗肿瘤的免疫新机制 发表期刊：Natu

肿瘤的发生、发展与进化是一个多因素参与、动态演变的复杂过程。其起源通常始于正常细胞内基因突变与表观遗传修饰的累积，这些分子层面的改变逐步打破细胞生长调控平衡，最终引发细胞恶性转化与增殖失控。在此过程中，肿瘤细胞通过持续适应微环境压力——如缺氧、营养匮乏及免疫监视等——逐步获得侵袭、迁移及免疫逃逸等恶性表型特征。随着疾病进展，肿瘤内部的细胞异质性不断加剧：不同克隆在进化谱系中分化出不同分支，呈现出基因型与表型的多样化特征。这种异质性赋予肿瘤在治疗压力下的适应性优势，既可通过选择性扩增耐药克隆，也可通过产生新的适应性突变来逃避治疗干预。与此同时，肿瘤细胞与微环境中的免疫细胞、基质细胞等通过复杂的信号交互进一步重塑生态位，持续推动肿瘤的进化进程。因此，深入解析肿瘤发生、发展与进化的分子机制，对于开发高特异性早期诊断标志物、精准预测疾病进展轨迹及制定个体化治疗策略具有至关重要的理论与临床价值。接下来，我们将通过典型案例，阐述如何利用单细胞与空间组学技术解析肿瘤的发生、发展与进化过程。案例一：空间原位分析构建食管癌单细胞多阶段空间动态演化图谱 发表期刊：Cancer Cell影响因子：44.5

肿瘤细胞的异质性与状态转换作为肿瘤生物学的核心特征，承载着极为关键的生物学意义。肿瘤并非单一克隆细胞的简单堆砌，其内部存在着显著的遗传变异与表观遗传重塑，而这些变化又进一步驱动了细胞状态及功能的多样化。

前言：肿瘤研究的核心科学问题：挑战与复杂性交织的生命谜题 肿瘤，这一古老而顽固的生命之敌，其发生、发展与演化的复杂性远超想象。理解肿瘤，本质上是解析一个在时空维度上动态演化的异常生态系统。其核心科学问题构成了一座座亟待征服的科学高峰： 肿瘤异质性的本质与根源：肿瘤绝非单一克隆的简单堆积。其内部存在惊人的遗传变异（驱动基因突变、拷贝数变异、染色体不稳定性）、表观遗传重塑（DNA 甲基化、组蛋白修饰改变）以及由此驱动的细胞状态（干性、分化、间质化、代谢状态）和功能（增殖、侵袭、迁移、治疗抵抗）的多样性。这种异质性如何在肿瘤进化树中产生（分支进化 vs. 线性进化）？微环境压力（如免疫攻击、缺氧、营养剥夺）如何塑造和选择不同的克隆或亚群？肿瘤干细胞在维持异质性和驱动复发转移中扮演何种角色？理解异质性层次（瘤内、瘤间、原发灶与转移灶间）及其动态变化，是破解肿瘤可塑性、治疗抵抗和转移扩散的关键。 肿瘤微环境（TME）的构成、功能及其双向互作：肿瘤并非孤立存在，而是深嵌于一个由免疫细胞（T 细胞、B 细胞、NK 细胞、巨噬细胞、髓系抑制细胞等）、基质细胞（成纤维细胞、内皮细胞、周细胞）、神经细胞、

人类的前额叶皮层 (PFC) 不成比例地扩大，负责高级认知和执行机能。它的运转失灵可能导致精神疾病，如精神分裂症和阿尔茨海默病。人们对小鼠 PFC 进行了积极研究，但它缺乏与颗粒状额叶皮层相对应的区域，这表明它与灵长类动物存在巨大的结构性差异。因此，我们的研究小组正在使用狨猴这种原产于南美洲的小型猴子作为灵长动物模型。 在这项实验中，我们研究了 PFC 与丘脑网状核 (TRN) 之间的相互作用，后者是丘脑周围的一组抑制性神经元。TRN 就像一扇门，控制着从大脑皮层向丘脑的信息传输。我们研究了 TRN 中轴突纤维的详细形态，它们将信号从 PFC 传递到丘脑。 图 1. 显示神经轴突如何从前额皮质通过丘脑网状核进入丘脑的示意图。丘脑网状核起着通往丘脑大门的作用。 1.采用简单工作流程的宏观到微观成像起源于 PFC 的轴突纤维以厚束形式穿过一个叫作内囊的通道。这个轴突束穿过 TRN 的前部进入丘脑，在那里通过分裂和重新定向呈现出复杂的形态。为了准确识别 TRN，我们使用了 PV（小白蛋白）作为标记物（图 1）。 FLUOVIEW FV3000 共聚焦激光扫描显微镜的宏观到微观功能可无缝连接

1.在降低漂白的同时对精细和复杂组织结构进行成像由于神经和血管在狭窄区域内形成了复杂结构，所以很难对膝关节骨骺中的血管和感觉神经进行成像。FLUOVIEW FV3000 共聚焦显微镜利用其高检测灵敏在低激光下对精细结构进行明亮的高分辨率成像，从而有助于降低对样品的光漂白。利用 FV3000 显微镜这一特点，我们成功对穿透胫骨骨骺椎孔的复杂 3D 结构的感觉神经及其周围血管进行成像。 图 1. 感觉神经和周围脉管系统穿透胫骨骨骺椎孔（3D 图像）。感觉神经（EYFP，青色）；血管（Alexa Fluor 594，洋红色）；细胞核（DAPI，橙色）。 成像设备：显微镜：FLUOVIEW FV3000 共聚焦显微镜系统 奥伟登（Evident）现已推出全新共聚焦显微镜物镜：100 倍硅油物镜（UPLSAPO100XO） 2.观察胫骨骨骺的神经血管结构了解膝关节的血管和神经投射对于缓解膝关节病疼痛非常重要。然而，研究人员至今仍然无法全面观察感觉神经和血管贯穿整个膝关节的精细结构。利用 FV3000 共聚焦显微镜，我们首次清晰地观察到这些结构。我们发现，膝关节感觉神经不仅存在于半月板，也存在

NanoBiT 是一种结构互补报告分子系统，可用于 PPI 的细胞内检测。它已成功应用于药物筛选、信号传导分析和病毒感染机制分析等一系列研究领域。该系统由一个大型 BiT（LgBiT；17.6 kDa）和一个小型 BiT（SmBiT；11 个氨基酸）亚基组成，它们将与目标蛋白质融合。这些亚基随后在细胞中表达，因此只有靶向 PPI 才能使这些亚基形成功能酶，从而产生明亮的发光信号（图 1）。 图 1. NanoBiT 蛋白质相互作用系统概览（图像 Promega 提供） 1.NanoBiT 的细胞内定位成像为进行细胞溶质和核酸表达，我们将两种载体对转染到 HeLa 细胞中。第一对为非靶向 FKBP-SmBiT 控制载体和 FRB-LgBiT 控制载体。第二对为细胞核靶向 NLS-FKBP-SmBiT 控制载体和 FRB-LgBiT 控制载体（图 2）。已知 FKBP 和 FRB 会在西罗莫司治疗下结合。 图 2. FKBP/FRB NanoBiT 和 NLS-FKBP/RRB NanoBiT 的细胞内定位 然后使用 IXplore Live for Luminescence 显微镜系统

1. 超级色差校正物镜PLAPON60XOSC 在脑组织四重免疫荧光中的应用在利用光学显微镜（如共聚焦显微镜）获取荧光图像之前使用荧光染料标记分子的方法，已成为可视化生物组织和细胞分子定位的最常用实验方法。然而，由于物镜的色差导致难以使用荧光染料精准显示紫外光和近红外区域中的细胞间共定位，因此在单个标本中很难获得多个细胞间共定位的准确数据。奥伟登（Evident）超级色差校正物镜 PLAPON60XOSC 即使在紫外和近红外区域也能以几乎没有色差的方式准确显示荧光标记分子。下面介绍使用四种类型的荧光抗体在单个标本中准确展示荧光标记分子的共定位情况。 PLAPON60XOSC 和 UPLSAPO60XO 的性能比较 2.超级色差校正物镜的应用-脑组织的四重免疫荧光 图 1. 脑组织的四重免疫荧光。VIAAT 染色（Alexa Fluor405，蓝色）；CB1 染色（Alexa Fluor488，绿色）；VGluT3 染色（Cy3，红色）；DGLα染色（Alexa Fluor647，白色）。 大麻素合成酶 DGLα（白色）和大麻素受体 CB1（绿色）聚集在小鼠基底杏仁核的锥体细胞躯体（星

1.使用让标本透明的透明化技术进行深层组织观察使用激光共聚焦显微镜对透明化标本进行深层组织观察时，物镜选择非常重要。观察这些样品时，奥伟登（Evident）硅油物镜系列具有出色的性能。以下，我们讨论了使用 FLUOVIEW 系列共聚焦激光扫描显微镜和硅油物镜对透明化标本的深层组织进行高分辨率观察的两个示例。 2.使用 SCALEVIEW-A2 进行透明化小鼠大脑切片的深层组织观察SCALEVIEW-A2 是奥伟登（Evident）用于让生物标本透明的产品。可消除光散射，且不会降低福尔马林固定生物标本的光吸收或荧光。将哺乳动物的脑标本浸没在 SCALEVIEW-A2 溶液中会让其变得透明。无需脑标本切片即可观察到从表面到组织深处标记荧光蛋白的结构。 我们使用 FLUOVIEW 系列共聚焦激光扫描显微镜，对使用 SCALEVIEW-A2 渲染透明的小鼠大脑切片进行了成像。使用 60X 油浸物镜拍摄的图像与 60X 硅油物镜 UPLSAPO60XS2 拍摄的图像进行比较。 使用 60X 油浸物镜和 60X 硅油物镜，拍摄并渲染透明的小鼠大脑的新皮层切片，进行深层组织图像比较。荧光抗体染色：V

1.相衬方法的变化图 1 通过相应的光学元件排列简要说明了无需染色即可观察透明物体的常见相位可视化方法。传统的相位可视化方法通过在聚光镜光瞳和物镜光瞳中分别放置特定光学元件来实现。 图 1. 各种相位可视化方法的光路布置。各种相位可视化方法的必要光学元件。a. 相衬方法；b. 微分干涉方法；c. 调制对比方法；d. 渐变对比方法。 相衬方法（图 1a）组合使用带环状孔径的专用聚光器透镜和含有相位膜环的专用物镜透镜。在通过聚光镜环状孔径的光线中，那些直接通过样品的光线会通过物镜光瞳的相位膜。另一方面，被样品偏转的光线在相位膜外通过，从而在两个分量相互干扰的点产生明暗对比。这一过程的典型特征是，在样品的折射率分布发生变化的梯度处会出现光晕现象。厚样品不适合采用这种方法，因为会出现过强的光晕。微分干涉方法（图 1b）是一种偏振剪切干涉仪，在聚光镜光瞳和物镜光瞳位置装有互补的沃拉斯顿棱镜。样品图像变为在固定方向上略微偏移的重像，并且样品的折射率梯度带有阴影，使其看起来具有三维立体感。由于采用了偏光干涉，如果有塑料皮氏培养皿或其它物体在光路中造成偏振失真，则无法进行观察。调制对比方法（图 1c

2023 年 2 月 3 日，浙江大学医学院脑科学与脑医学学院白戈课题组与合作者在 Cell 杂志 ( IF = 66.850 (2022) / JCR 分区: Q1 ) 以封面文章形式在线发表研究论文。该工作发现虽然在正常生理状态下不同 CMT 致病蛋白在细胞中的定位各异，但在应激状态下这些 CMT 致病蛋白会表现出相同的细胞定位，进入应激颗粒中并与其核心蛋白 G3BP 发生异常互作，引起应激颗粒异常，使得周围神经应对环境不良刺激的能力下降，从而导致周围神经病的发生。 该研究首先使用浙江大学医学院公用技术平台奥伟登（Evident）FV3000 激光共聚焦显微镜 奥伟登（Evident）现已推出全新共聚焦显微镜，在 HeLa 细胞、鸡胚运动神经元和小鼠原代培养运动神经元中确定了导致 CMT2D 亚型的 GlyRS 蛋白能够在应激状态下进入到应激颗粒中（图 1），同时利用该显微镜的时间序列和 FRAP 成像模块获得数据揭示了 GlyRS 致病蛋白对神经元生长长度的影响及 GlyRS 致病蛋白对应急颗粒动态性的影响。 图 1. GlyRS 蛋白在应激下定位到 SG 中。A-C：He

2024 年 5 月 15 日，四川大学生物治疗全国重点实验室贾大课题组与合作者在 Nature communications 杂志 ( IF = 16.6 (2023) / JCR 分区: Q1 ) 在线发表了题为「TRIM25 predominately associates with anti-viral stress granules」的研究论文。该工作利用 G3BP1 邻近蛋白生物素化标记实验发现 TRIM25 是抗病毒 SG 的有效标记物。课题组成员发现 TRIM25 会独立发生 LLPS 现象，而 dsRNA 的存在会显著增强这种反应。Poly(I:C) 处理和 RNA 病毒感染都会引发 TRIM25 和 G3BP1 的共相分离，从而显著提高 TRIM25 对底物的泛素化活性，其中许多底物都定位于 SGs 中。TRIM25 和 G3BP1 的共相分离对激活 RIG-I 信号通路和限制 RNA 病毒感染至关重要。该研究不仅为抗病毒信号通路的调控提供了新的见解，而且为研究应激特异性 SG 亚型的组成、动态和功能建立了一个研究范式。 该研究首先采用了一种邻近生物素化标记（Bio

2025 年 4 月 2 日，由陆军军医大学牛建钦教授、万瑛教授与中山大学附属第七医院易陈菊研究员联合带领的研究团队在 Science translational medicine 上发表研究论文，首次揭示了少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte precursor cell, OPC）在多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）早期病理过程中触发免疫反应级联激活，并导致快速脱髓鞘的新机制。 MS 是一种以中枢神经系统脱髓鞘为核心病理特征的自身免疫性疾病，全球患者超 280 万。其典型表现为免疫细胞异常浸润引发的神经髓鞘损伤、轴突退化甚至不可逆的神经功能障碍 [1]。尽管现有疗法可延缓疾病进展，但早期病理机制不明、缺乏特异性干预靶点仍是临床面临的重大挑战。陆军军医大学牛建钦教授团队前期研究发现，MS 患者脑内 OPC 存在 Wnt 信号通路异常激活现象，且其病理复杂性远超小鼠模型，但此类病理性 OPC 如何驱动疾病进展尚不清楚 [2,3]。近日，研究团队在 Science translational medicine 发表论文揭示：MS 病理条件下，OPC

冻存和复苏

细胞治疗技术正扮演着越来越重要的角色。其中，CAR-T 细胞治疗、间充质干细胞（MSC）治疗以及 T 细胞治疗是三种备受关注的细胞治疗方法。这些治疗方法通过采集患者体内的特定细胞，经过体外激活、修饰、扩增等步骤，再将这些具有特定功能的细胞移植回患者体内，以达到治疗疾病的目的。为了更好地理解和应用这些治疗技术，下面我们将整合并详细叙述这三种细胞治疗的流程图内容，为研究人员和临床医生提供一个清晰的操作指南。CAR-T 细胞治疗流程间充质干细胞治疗流程 T 细胞治疗流程