抗原修复方法 Antigen Retrieval Methods

虽然固定对于保持组织形态至关重要，但该过程也可能对免疫组化/免疫细胞化学检测产生负面影响。固定会改变蛋白质的生化性质，导致目标表位被掩盖，从而无法与一抗结合。表位被掩盖的原因可能是表位内氨基酸的交联、表位附近或位点无关肽段的交联、表位构象的改变或抗原静电荷的改变。抗原修复是指任何能够逆转表位掩盖并恢复表位-抗体结合的技术。

抗原修复技术

抗原修复的必要性取决于多种因素，包括但不限于目标抗原、所用抗体、组织类型以及固定方法和时间。由于多克隆抗体能够识别多个表位，因此与单克隆抗体相比，它们无需抗原修复技术即可检测到特定抗原。

恢复表位免疫反应性的方法有很多种。即使是改变抗体稀释液的pH值或阳离子浓度这样简单的方法，也能影响抗体与其表位的亲和力。对于部分掩蔽的表位，在进行抗原修复之前，可以先尝试延长一抗的孵育时间。然而，这一步骤也需要进一步优化，包括合适的抗体浓度、孵育时间和温度。在讨论抗原修复方法时，通常将其分为两大类：蛋白酶诱导表位修复（PIER）和热诱导表位修复（HIER）。一旦优化，抗原修复的效果将非常显著。

蛋白酶诱导表位修复（PIER）

在PIER方法中，蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等酶已被成功用于恢复抗体与其表位的结合。其作用机制被认为是切割可能掩盖表位的肽段。PIER的缺点是恢复免疫反应的成功率较低，并且可能破坏组织形态和目标抗原。

热诱导表位修复（HIER）

HIER被认为可以逆转某些交联，并恢复表位的二级或三级结构。该方案必须针对每种组织、固定方法和待研究的抗原进行优化。一般来说，HIER的成功率远高于PIER。HIER可在微波炉、高压锅、蒸锅、高压灭菌器或水浴锅中进行。微波炉是HIER中越来越常用的设备。这些方案通常包括5分钟的加热，然后更换缓冲液。对于所有HIER方法，玻片必须在开始IHC/ICC孵育之前冷却。HIER对时间、温度、缓冲液和pH值特别敏感，最佳方法必须通过实验确定。

热诱导抗原修复（HIER）方案

优化与局限性

抗原修复可能需要提高样本与载玻片或盖玻片的粘附性。此外，该技术通常对冰冻切片和酒精固定的组织过于苛刻。时间、温度和pH值也必须针对每种设备进行优化（例如，在92-95℃水浴中处理5-10分钟，或在120℃高压锅中处理1-5分钟）。为了优化抗原修复，必须使用一系列时间、温度和pH值组合进行初步研究。在使用任何抗原修复方法时，都应始终考虑人为染色的可能性。由于染色在任何给定的实验中都受多种变量的影响，因此应使用对照来验证特异性抗体结合。

R&D Systems 提供多种试剂，可提高组织抗原检测率并增强免疫反应性。在初始优化阶段，研究人员可将经中性 pH 7.0 通用抗原修复液（产品编号：CTS015）处理的样本与未经抗原修复的相同组织切片进行比较。根据组织的不同，可能需要使用酸性或碱性抗原修复液进行后续测试。R&D Systems 发现，使用碱性抗原修复试剂（产品编号：CTS013）进行处理通常效果良好。我们还提供酸性（产品编号：CTS014）和采样器（产品编号：CTS016）抗原修复试剂。与中性溶液相比，酸性和碱性抗原修复液更容易影响组织形态。

此表展示了确定最佳HIER孵育时间和pH值的典型实验装置。实验结果应与未进行HIER处理的第十张载玻片进行比较。类似的方法也可用于优化孵育温度。

抗原修复可提高p27的检出率。免疫组化（IHC）图像显示，在指定的抗原修复液中于95℃孵育10分钟后，石蜡包埋的人前列腺癌组织切片中p27的检出率显著提高。与未进行抗原修复处理相比，在pH值为7.0的中性抗原修复液（pH 9.5，货号CTS013）和pH值为9.5的碱性抗原修复液（货号CTS013）中孵育后，p27的检出率显著提高，但在pH值为5.0的酸性抗原修复液（货号CTS014）中则无此效果。p27的检测采用抗人/小鼠/大鼠p27单克隆抗体（货号MAB22561；棕色）。