IHC/ICC样本的适当固定

所有用于免疫组化/免疫细胞化学实验的样本都必须进行固定，以保持组织形态并保留靶分子的抗原性。固定会改变组织的化学成分，通常需要在保持组织结构和保留抗原表位之间做出权衡。细胞或组织固定不完全（固定不足）可能导致组织内靶蛋白快速蛋白水解降解，从而降低特异性免疫反应性。然而，过度固定（固定过量）可能导致抗原表位被掩盖或产生强烈的非特异性背景染色，从而掩盖特异性标记。固定方法和时间的选择必须结合样本制备进行考虑。此外，固定时间、温度和pH值都会影响固定程度。

甲醛

甲醛是用于保存组织和细胞内蛋白质靶标的最常用固定剂。甲醛介导的组织固定被认为依赖于蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸交联的形成，这些交联涉及亚甲基桥（-CH₂- _）。甲醛可以化学连接氨基（NH₂ _）和肽键（CONH）、氨基（NH）_和氨基（NH）或氨基（NH）和氨基（ _NH₂ ）。

甲醛是大多数免疫组化/免疫细胞化学应用中的良好选择，但并非万能固定剂。甲醛过度固定会改变表位中的氨基酸，从而阻碍抗体与其结合。然而，在大多数情况下，可以通过抗原修复技术暴露表位，恢复抗体结合。在这种情况下，冰冷的无水甲醇或无水乙醇是合适的替代固定剂。

注：虽然有很多种固定剂可供选择，但甲醛是最常用的，也是大多数免疫组化/免疫细胞化学实验的合适起始固定剂。甲醛溶液应分装后冷冻保存，或在 4-8 °C 下保存，保存时间不应超过一个月。

 

醇类

用于细胞和组织固定的最常用醇类是甲醇和乙醇。甲醇和乙醇的分子结构与水非常相似。因此，它们会与水竞争蛋白质氢键，取代组织中的水分子。这会导致蛋白质在其等电点处沉淀，降低其介电常数，并可能由于构象变化而阻断抗体与表位的结合。醇类通过破坏疏水键影响蛋白质的三级结构，但它们似乎也能稳定蛋白质的二级结构。

然而，人们普遍认为，醇类固定剂在保持组织形态方面不如甲醛类固定剂。醇类的渗透性不如甲醛，主要用于固定冷冻组织切片和细胞。因此，醇类固定更适用于膜表面抗原。醇类固定后不建议进行抗原修复，因为抗原修复通常被认为过于剧烈，可能会破坏组织切片或细胞的完整性。

丙酮

丙酮是一种强脱水剂，可导致组织蛋白不可逆沉淀。它通常用于未经固定、速冻的组织切片，之后再用酒精或甲醛进行固定。

组织固定

对于研究小鼠、大鼠和豚鼠等小型动物的完整组织而言，全动物灌注固定通常是保存抗原的最佳方法。该方法是将动物的体循环血液替换为固定液。然而，全动物灌注可能不足以固定目标组织。在这种情况下，可以将解剖后的组织浸入固定液中。例如，4%甲醛PBS溶液是组织灌注和浸入固定的常用溶液。

为了增强浸泡固定过程中固定液的渗透性，建议组织厚度不超过10毫米。为达到完全固定，固定液的体积应为组织体积的50-100倍。固定通常在室温下进行4-24小时。优化固定条件至关重要，因为固定不足或过度固定都可能降低或消除组织的免疫反应性。

培养细胞的固定

与组织样本相比，培养细胞可以用浓度较低的固定液在较短时间内固定。例如，在室温下用2%甲醛溶液固定20分钟通常足以保持细胞形态和抗原性。

通常，细胞培养的固定方法是直接弃去培养基，加入固定液。然而，弃去培养基后表面张力的变化可能会损伤某些类型的细胞。在这种情况下，可以将固定液直接加入培养基中。例如，加入与培养基体积相同的4%甲醛溶液，即可得到2%的甲醛溶液，其浓度足以预固定细胞。2分钟后，应将预固定培养基更换为新鲜的2%固定液。预固定步骤使细胞更加坚硬，从而能够承受表面张力变化可能造成的任何有害影响。

注意：固定可能导致组织蛋白发生疏水交联。交联程度取决于固定时间、温度、pH值和所用固定剂。一旦固定方案优化完毕，应始终采用相同的步骤。