基因递送的多面手：慢病毒载体

目前慢病毒载体主要应用在以下几个方面：

• 细胞基因治疗（截止目前，已上市的 CAR-T 产品有 9 款采用了慢病毒载体递送 CAR 基因）
• 基因表达调控（过表达、RNA 干扰研究等）
• 基因编辑（CRlSPR/Cas9 gRNA 文库筛选、基因敲除、敲入、点突变、基因激活/抑制）
• 稳转细胞株构建
• 活体细胞成像追踪
• 转基因动物

图 1 慢病毒载体的主要应用方向

 

应用案例

 

案例 1：用慢病毒载体进行基因过表达，构建稳转细胞株，研究葡萄糖激酶在前列腺癌（PCa）中的作用 1

细胞代谢在肿瘤进展中起着关键作用，靶向癌症代谢可能有效地杀死癌细胞。本文旨在研究葡萄糖激酶在前列腺癌中的作用，并确定 PCa 治疗的关键靶点。

实验设计和主要研究结果：

• 癌症基因组图谱（TCGA）数据库和在线工具评估结果显示 ADP 依赖型葡萄糖激酶（ADPGK）是唯一一种在前列腺腺癌（PRAD）中上调并预测较差总生存（OS）的葡萄糖激酶。临床样本分析显示，与非 PCa 组织相比，ADPGK 在 PCa 组织中显著上调。
• ADPGK 过表达促进了 PCa 细胞的增殖和迁移，而敲低 ADPGK 则抑制了恶性表型。
• 代谢组学、蛋白质组学以及 ECAR 和 OCR 测试揭示了 ADPGK 显著加速了 PCa 的糖酵解。
• ADPGK 与丙酮酸激酶 C（ALDOC）结合，通过 AMP 激活蛋白激酶（AMPK）磷酸化促进糖酵解。

图 2 用于 ADPGK 过表达的慢病毒结构示意图及 ADPGK 过表达结果。

 

案例 2：用慢病毒载体递送 RNA 干扰工具，研究脯氨酸羟化酶结构域蛋白在调节心肌细胞钙水平中的功能 2

由于高氧消耗，心肌细胞对环境中的氧气极为敏感。脯氨酸羟化酶结构域蛋白 2（PHD2）是一种氧气传感器，对细胞缺氧适应性至关重要。近年来的研究发现，PHD 抑制剂（PHIs）和针对 PHD2 的小干扰 RNA（PHD2shRNA）可以在不影响细胞能量水平的情况下激活 AMPK，将细胞缺氧信号转化为能量代谢信号，使细胞产生能量保护反应，并显著提高细胞对缺氧的抵抗力。研究还发现，信号分子钙（Ca2+）在响应缺氧的 AMPK 信号通路激活中发挥着重要作用。然而，PHD 活性如何增加细胞内 Ca2+水平并激活 AMPK 信号通路的分子机制仍然不清楚。

 

实验设计和主要研究结果：

• 确认 PHIs 诱导心肌细胞中的钙释放。
• PHD2 在心肌细胞中激活肌浆网通道辅助蛋白 CaMKⅡ。用 shRNA 干扰技术敲低心肌细胞中 PHD2，Western blot 证实了 PHD2 的沉默。与对照细胞相比，沉默 PHD2 显著增加了 CaMKⅡ的磷酸化。
• Ca2+在心肌细胞中介导 PHI 刺激引起的 AMPK 激活。肌浆网通道抑制剂瑞安诺丁显著降低了 PHI 处理诱导的与 Ca2+相关的荧光强度。慢病毒介导的 RyR2 特异性 shRNA 显著降低了 RyR2 在 mRNA 水平上的表达。此外， IP3R 阻断剂 2-APB 预处理或慢病毒介导的 IP3R 特异性 shRNA 均未显著影响 PHI 处理诱导的 P-AMPK 水平。2-APB 预处理对 PHI 诱导的 Ca2+荧光也无显著影响。这些结果表明，PHI 诱导的钙释放和 AMPK 激活主要由肌浆网通道而非 IP3R 通道调节。
• CaMKⅡ介导 PHI 诱导的钙释放和 AMPK 激活。PKA 不参与 PHI/Ca2+/AMPK 信号通路，而 CaMKⅡ在 PHI/Ca2+/AMPK 信号通路中发挥着重要作用。
• TRPA1 介导 PHI/Ca2+/AMPK 信号通路的激活。TRPA1 抑制剂 HC030031 预处理显著抑制了 PHI 诱导的 P-AMPK 和 P-CaMKⅡ增加，并显著减少了 PHI 诱导的 Ca2+荧光。PHD2 shRNA 组中 TRPA1 蛋白水平显著高于对照组。这些结果强烈表明 TRPA1 在 PHD 诱导的 Ca2+释放途径中发挥着至关重要的作用。

 

图 3 慢病毒介导的特异性 shRNA 对 PHD2、RyR2 和 IP3R 的敲低效果。

 

案例 3：慢病毒递送高灵敏度的报告基因 Akaluc 用于追踪胶质瘤的体内生长、侵袭和转移过程 3

使用非侵入性生物发光成像（BLI）对肿瘤生长进行纵向追踪是研究体内癌症模型的关键方法。Akaluciferase（Akaluc）是一种新的 BLI 系统，其信号强度高于标准的萤火虫荧光素酶（Fluc）。本文设计了一种慢病毒载体，用于在胶质瘤细胞系中表达 Akaluc，追踪胶质瘤的体内扩张过程。

 

实验设计和主要研究结果：

• Akaluc 和 Fluc 报告基因的设计和灵敏度比较。用表达 Venus-Akaluc 或 Venus-Fluc 融合蛋白的慢病毒载体转导人 GBM 细胞系 U87 MG 和小鼠高级别胶质瘤细胞系 GL261，结果显示病毒载体转导对胶质瘤细胞的增殖率没有显著影响，表达 Akaluc 的细胞比表达 Fluc 的细胞的 BLI 信号强大约 10 倍。
• 颅内移植表达 Akaluc 的胶质瘤细胞产生超过 Fluc 100 倍的 BLI 信号。将 GL261-Venus-Akaluc 和 GL261-MSCV-Fluc 胶质瘤细胞颅内植入到同系的 C57BL/6 小鼠中，在所有时间点，Venus-Akaluc 组的 BLI 信号显著高于 GL261-Fluc 组。
• Akaluc BLI 系统可以追踪更少数量的移植胶质瘤细胞，从而有助于更准确地模拟肿瘤发生和早期肿瘤生长。
• Akaluc BLI 系统可用于在体内对胶质瘤治疗反应进行纵向追踪。

 

总之，Akaluc BLI 提供了一种敏感的方法用于体内追踪胶质瘤生长、侵袭和转移，特别适用于对较小的肿瘤进行成像以及监测治疗后的肿瘤复发。

图 4 用于递送 Akaluc BLI 系统的慢病毒载体结构示意图以及 Akaluc BLI 系统体内示踪效果。

参考文献：

[1]Xu H, Li YF, Yi XY, Zheng XN, Yang Y, Wang Y, Liao DZ, Zhang JP, Tan P, Xiong XY, Jin X, Gong LN, Qiu S, Cao DH, Li H, Wei Q, Yang L, Ai JZ. ADP-dependent glucokinase controls metabolic fitness in prostate cancer progression. Mil Med Res. 2023 Dec 12;10(1):64.

[2]Liu L, Liu X, Liu M, Xie D, Yan H. Proline hydroxylase domain-containing enzymes regulate calcium levels in cardiomyocytes by TRPA1 ion channel. Exp Cell Res. 2021 Oct 15;407(2):112777. doi: 10.1016/j.yexcr.2021.112777. Epub 2021 Aug 11.

[2]Bozec D, Sattiraju A, Bouras A, Jesu Raj JG, Rivera D, Huang Y, Junqueira Alves C, Tejero R, Tsankova NM, Zou H, Hadjipanayis C, Friedel RH. Akaluc bioluminescence offers superior sensitivity to track in vivo glioma expansion. Neurooncol Adv. 2020 Oct 10;2(1):vdaa134. doi: 10.1093/noajnl/vdaa134.