病毒工具常见问题
派真生物
1、研究中该如何选择 AAV 血清型和剂量？
您可以在我们的血清型选择指南中找到所有血清型和组织趋向性的介绍。
2、重组 AAV 是复制缺陷的吗？
对于野生型 AAV，如果没有辅助病毒（如腺病毒）的存在，其复制效率极低。对于现在生产的重组 AAV，复制和衣壳基因是在 Rep/Cap 质粒中提供的。只有 AAV 基因组的两个 ITR（倒置末端重复序列）被保留并包装成病毒颗粒，而所需的腺病毒基因要么是由腺病毒提供的，要么是由另一个质粒提供的。理论上，重组 AAV 是不可能复制的。
3、AAV 病毒载体表达目的基因效果差，可能是什么原因？
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可能的原因 |
解决方案 |
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AAV 血清型靶向特异性不足 |
测试不同的 AAV 血清型对靶标组织/细胞的特异性；通过基因工程修饰 AAV 的衣壳蛋白，改进 AAV 的靶向性 |
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病毒量不够 |
做预实验进行最佳感染剂量探索，确保使用适量的病毒 |
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启动子选择不当，目的基因表达量低 |
优化启动子选择，根据目标细胞类型选择合适的启动子 |
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mRNA 翻译效率低 |
增加 IRES 或其他元件来增强翻译效率；调整目的基因的序列以优化其 mRNA 结构，增加翻译效率 |
4、AAV（带荧光标记）体内感染后检测不到荧光或者荧光弱，可能是什么原因？
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可能的原因 |
解决方案 |
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病毒滴度过低 |
重新测定病毒滴度 |
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病毒失效 病毒颗粒在生产、保存或运输过程中可能受损，导致感染效率低或完全失效 |
检查病毒滴度；体外测试病毒的感染效果；重新包装病毒 |
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对目标组织/细胞的感染效率低 |
选择组织/细胞特异性 AAV 血清型 |
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荧光蛋白表达的问题 启动子选择不当：如果用于驱动荧光蛋白表达的启动子在目标组织中不活跃或不合适，可能导致荧光蛋白表达不足或不表达； 表达时间不足：荧光蛋白的表达可能需要一定的时间。如果感染时间不够长，荧光蛋白可能尚未充分表达，导致观察不到荧光。 |
使用合适的启动子以确保荧光蛋白在目标细胞中有效表达；增加感染时间，确保荧光蛋白有足够时间表达。 |
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荧光检测的问题 检测方法不敏感：如果荧光蛋白表达量较低，可能需要敏感的设备或技术来检测。如果检测设备灵敏度不足，可能导致检测不到荧光。 组织自发荧光：一些组织本身可能具有自发荧光，干扰了荧光蛋白的检测，使得实际的荧光信号被掩盖。 |
优化荧光检测方法，使用高灵敏度的荧光显微镜或其他检测设备。 |
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荧光蛋白的降解或失活 荧光蛋白降解：荧光蛋白可能在表达后被快速降解，特别是在特定组织中具有高降解酶活性的情况下，导致观察不到荧光信号。 pH 环境影响荧光：一些荧光蛋白对 pH 值敏感，在酸性环境下（如溶酶体）可能会失去荧光。 |
尝试使用稳定性更高或 pH 不敏感的荧光蛋白。 |
5、慢病毒感染细胞效率低，可能是什么原因？
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可能的原因 |
解决方案 |
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病毒滴度低，导致感染剂量不足 |
对病毒进行重新定量； 提高病毒滴度：浓缩病毒液，使用更高效的病毒包装系统； 优化感染复数（MOI）：通过逐步增加 MOI 值来测试最佳的感染量 |
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目标细胞对慢病毒的敏感性低 |
慢病毒通常在其表面有 VSV 糖蛋白，并利用它与细胞表面的 LDL 受体结合。如果目标细胞没有表达大量的 LDL 受体（如某些物种的干细胞系表面的 LDL 受体表达水平低），那么无论你使用多高的 MOI，都不会获得良好的转导效率。用流式细胞术、免疫荧光等方法确定靶细胞表面 LDL 受体的表达水平，选择 LDL 受体表达水平高的靶细胞来进行病毒感染实验 |
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缺乏感染增强剂（如 Polybrene）或其浓度不足 |
添加感染增强剂：如添加 Polybrene 或 DEAE-Dextran，浓度可优化至 4-8 μg/mL |
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培养条件（如温度、pH 等）不适合病毒感染 |
将细胞培养环境控制在最佳状态，并保持培养基的新鲜 |
6、加入慢病毒后，细胞死亡率很高，该如何处理？
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可能的原因 |
解决方案 |
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病毒量过高，导致细胞负荷过重 |
减少病毒量，降低 MOI。在感染后 4 小时、8 小时、12 小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差，则需要立刻对细胞进行换液操作，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液 |
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感染增强剂浓度过高，具有毒性作用 |
降低感染增强剂浓度，并考虑减少暴露时间 |
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转染的基因对细胞有毒性 |
改进基因设计，使用不同的启动子或条件诱导型表达系统，避免毒性基因的持续过表达 |
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细胞状态不佳或培养条件不适 |
确保细胞健康，优化细胞生长状态，选择对慢病毒耐受性好的细胞系 |
7、病毒感染后 qPCR 检测无过表达效果，可能是什么原因？
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可能的原因 |
解决方案 |
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靶细胞目的基因内源表达水平太高，影响了外源基因的表达 |
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检测引物设计问题 |
过表达构建的都是 CDS 区，所以引物必须设计在 CDS 区才能检测出外源的过表达 |
8、病毒感染后 qPCR 检测无敲低效果，可能是什么原因？
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可能的原因 |
解决方案 |
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目的基因的表达水平过低 |
在敲低之前用 qPCR 检测目的基因的表达水平，选择 Ct 值<30 的目的基因进行下一步的敲低实验 |
9、实验重复性差，可能是什么原因？
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可能的原因 |
解决方案 |
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病毒的滴度和质量不一致 |
标准化病毒生产：每次实验中确保病毒滴度和质量的稳定性，使用统一的方法和条件生产和浓缩病毒 |
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细胞状态的波动影响了实验结果 |
标准化细胞培养，保持细胞在同一生长条件下，确保细胞状态一致 |
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实验操作不规范，导致数据差异 |
记录并优化操作流程，详细记录每一步骤，优化实验流程以减少误差来源 |
10、用于慢病毒感染的细胞接种量是多少？
根据细胞增殖速度调整细胞接种量，保证感染后 4 天左右细胞刚好增长达到 90%～100% 的汇合度。对于大部分细胞系，接种密度保持在 20%～30%；对于原代细胞，接种时提高汇合度到 50%～60%。
11、向细胞中加入慢病毒的最佳时间是？
在细胞汇合度 20%～40% 且细胞状态良好时加入慢病毒，感染后 4 天细胞增长达 90%～100% 的汇合度。
12、如何确认最佳感染条件？
使用不同助感试剂和不同的细胞数与病毒颗粒数比例进行感染预试验，感染后选择感染效率在 80% 左右，感染后细胞状态正常且病毒使用量最小的感染条件作为最佳感染条件。
