单细胞 RNA 测序

单细胞转录组测序是在单个细胞水平上对全转录组进行扩增与测序的技术，能够揭示组织内部的细胞异质性。

利用微流控芯片（如 10x Genomics 平台），将单个细胞与带有特异性细胞标签（Cell Barcode）、分子标签（UMI）及 Oligo(dT) 的凝胶珠（Gel Bead）共同包裹在微油滴（GEM）中。在油滴内裂解细胞并完成逆转录，从而给来自同一细胞的所有 mRNA 加上相同的“身份证”。

• 细胞分群：发现组织中的未知细胞类型或亚群。
• 发育轨迹（拟时序分析）：研究干细胞分化、免疫细胞活化等动态演变过程。
• 肿瘤异质性：分析肿瘤微环境中的微量免疫细胞和基质细胞。

1. 单细胞悬液制备：通过机械法和酶消化法（如胶原酶、胰酶）将实体组织解离为单个细胞。
2. 细胞活性质控：利用台盼蓝染色或流式细胞仪检测细胞活性及浓度。
3. 微流控捕获（10x 捕获）：将细胞悬液载入芯片，形成包含“单细胞+单凝胶珠”的油滴。
4. 油滴内逆转录：凝胶珠溶解，释放引物，在油滴内完成一链 cDNA 合成并带上 Barcode。
5. 破乳与文库构建：打破油滴，合并所有 cDNA 进行全转录组扩增（IVT 或 PCR），随后进行常规片段化及接头连接。
6. 深度测序：由于细胞数量多，每个样本通常需要测定数亿条 Reads（平均每细胞至少 20k-50k Reads）。

• 时间决定成败：从组织离体到细胞上机必须越快越好（通常控制在 1-2 小时内），否则细胞会大量死亡或产生应激基因表达。
• 杜绝细胞团块：悬液中不能有细胞抱团或组织碎屑，否则容易堵塞微流控芯片的毛细管。

1. 问题：双细胞（Multiplet）比率过高。

原因：上机重悬的细胞浓度过高，导致一个油滴里塞进了两个或多个细胞。

2. 问题：线粒体基因表达比例过高（>20%）。

原因：说明样本中死细胞或垂死细胞过多，细胞膜破裂导致胞质 mRNA 漏出，而线粒体 RNA 被保留。