空间转录组测序

空间转录组测序将基因表达定量与组织切片病理形态学相结合，既能知道表达了什么基因，又能精确定位该基因在组织的什么位置。

以 10x Genomics Visium 为例：测序芯片载玻片上排列着数千个微小的捕获点（Spots），每个 Spot 内部都固着了带有空间位置标签（Spatial Barcode）的 Oligo(dT) 引物。将组织切片贴在芯片上，经染色成像后原位裂解，释放出的 mRNA 垂直沉降并被下方的引物捕获，随后逆转录建库。

• 肿瘤微环境空间构筑：研究肿瘤核心区、浸润前沿与基质区的免疫空间分布。
• 神经科学研究：大脑多层复杂结构（如皮层六层结构）的精确分子地图绘制。
• 发育生物学：胚胎发育过程中器官形成的空间位置特异性表达。

1. 组织冷冻包埋与切片：使用 OCT 包埋新鲜组织，冷冻切片至 10 \(\mu m\) 厚度并贴在空间芯片的捕获区。

2. 固定与染色成像：甲醇固定，进行 H&E 染色或免疫荧光染色，在显微镜下拍摄高分辨率明场/荧光组织图像。

3. 组织渗透（裂解）：加入裂解液，控制通透时间，使细胞内的 mRNA 垂直沉降并与芯片上的引物杂交。

4. 原位逆转录：在芯片上直接进行逆转录，使 cDNA 连上该位置特有的 Spatial Barcode。

5. 收集与二次链合成：洗脱杂交链，将 cDNA 转移至离心管中合成第二链并扩增。

6. 文库构建与测序：进行片段化、加接头、PCR 扩增后上机测序。

7. 数据空间映射：利用生物信息学软件（如 Space Ranger）将测序数据中的 Spatial Barcode 与先前拍摄的组织图像坐标进行对齐重合。

1. 组织通透时间（Permeabilization）优化：不同组织（如脑、肝、肌肉）的细胞紧密程度不同。正式实验前必须先做预实验（组织优化试验）确定最佳组织透化时间，时间太短无数据，时间太长 RNA 会横向扩散导致空间分辨率模糊。

2. 切片技巧：贴片时切片绝对不能有气泡或折叠。

1. 问题：图像与基因表达谱对齐失败。

原因：贴片时芯片四周的对齐框架标定点（Fiducial Frame）被组织遮挡，或者显微镜拍照的分辨率/对比度不足，软件无法识别对齐标记。

2. 问题：空间分辨率变差（基因表达发生模糊扩散）。

原因：透化处理时间过长，导致细胞裂解后 mRNA 未能立刻沉降，而是在溶液中发生了横向扩散。