mRNA测序

利用带有 Oligo(dT) 的磁珠特异性结合 mRNA 的 polyA 尾巴，将占总 RNA 80% 以上的核糖体 RNA（rRNA）去除。随后将富集到的 mRNA 片段化，逆转录成 cDNA 并连接测序接头，在测序仪上进行大规模平行测序。

• 差异表达分析：比较疾病组与对照组、药物处理前后的基因表达差异。
• 生物通路发现：通过基因富集分析（GO/KEGG）寻找关键代谢或信号通路。
• 生物标志物筛选：寻找与特定疾病表型相关的标志物。

1. RNA 提取与质控：提取总 RNA，用 Agilent 2100 检测 RNA 完整性（RIN 值）。

2. mRNA 富集：利用 Oligo(dT) 磁珠吸附富集 mRNA。

3. 片段化：在加温和二价阳离子条件下将 mRNA 打断成 200-300 bp 的片段。

4. cDNA 合成：随机引物逆转录合成第一链，随后合成第二链形成双链 cDNA。

5. 末端修复与加 A：补平双链末端，并在 3' 端加上单碱基 “A”。

6. 接头连接：连接带有样本 Index（标签）和测序引物位点的接头。

7. PCR 扩增与纯化：进行 10-15 轮 PCR 扩增富集文库，用 AMPure XP 磁珠 纯化并筛选片段大小。

8. 上机测序：文库质控合格后，进行高通量测序（通常为 PE150 双端测序）。

• RNA 完整性：动物样本的 RIN 值必须 \(\ge 7.0\)。若 RNA 已严重降解，polyA 尾巴会断裂，此时不能使用该方法。
• 防污染：操作全程必须在无 RNase 的环境中进行，定期喷洒 RNase Zap。

1. 问题：数据中 rRNA 残留率过高（>10%）。

原因：Oligo(dT) 磁珠洗涤不彻底，或总 RNA 起始量过高超出了磁珠结合饱和度。

2. 问题：文库出现二聚体峰（在 ~120 bp 处有尖峰）。

原因：接头连接过量或后期磁珠纯化（如 0.8× 筛选）未完全洗去未连接的接头。