简介
lncRNA-Seq 不仅能检测 mRNA，还能检测不带 polyA 尾巴的非编码 RNA（如 lncRNA、circRNA 等），并且能够明确区分 RNA 来自于 DNA 的正链（Sense）还是反链（Antisense）。
原理
由于不依赖 polyA 尾巴，首先使用针对性探针将 rRNA 去除（Ribozero）。在合成第二链 cDNA 时，用 dUTP 代替 dTTP。在连接接头后，利用 UNG（尿嘧啶-N-糖苷酶） 降解含有 dUTP 的第二链，仅对第一链（代表转录本原始方向）进行 PCR 扩增和测序。
用途
- 非编码 RNA 研究：长链非编码 RNA（lncRNA）、环状 RNA（circRNA）的鉴定与定量。
- 反义转录本研究：鉴定基因组同重叠区域正反两链分别转录出的不同基因。
- 降解样本测序：如临床 FFPE（石蜡包埋）样本，其 RNA 的 polyA 尾已断裂，必须用此方法。
材料与仪器
- 生物样本：常规样本或 FFPE 临床样本、细菌/原核生物样本（因细菌 mRNA 无 polyA 尾）。
- 核心试剂：Ribo-Zero 去除核糖体试剂盒、dUTP、UNG 酶、链特异性建库试剂盒。
步骤
1. 总 RNA 提取与质控：提取总 RNA（FFPE 样本需使用专门的脱蜡提取试剂盒）。
2. rRNA 去除：利用针对 rRNA 的磁珠探针特异性结合并清除 rRNA。
3. 片段化与一链合成：打断剩余 RNA，加入随机引物合成第一链 cDNA。
4. dUTP 标记二链合成：合成第二链，原料中以 dUTP 代替 dTTP。
5. 末端修复与接头连接：进行常规末端加 A 和接头连接。
6. U 链降解：加入 UNG 酶水解含有 dUTP 的第二链。
7. PCR 扩增与测序：扩增留下的第一链文库，质控合格后上机。
注意事项
1. 数据量要求更高：由于全转录组包含大量非编码 RNA 和杂带，其推荐测序深度（如 \(\ge 10\) Gb 或 50M Reads）通常高于常规 mRNA 测序。
2. 探针适用性：rRNA 去除试剂盒具有物种特异性（如人类/小鼠/大鼠通用，但植物或细菌需选择专用试剂盒）。
常见问题
1. 问题：链特异性（Strand specificity）比例低（低于 90%）。
原因：UNG 酶失活或降解时间不足，导致部分第二链未被彻底切断。
2. 问题：FFPE 样本出库量极低。
原因：石蜡样本中的 RNA 存在严重的片段化和交联，需增加 PCR 循环数（如增至 15-18 轮），但需注意这会增加 Dup 率（重复序列率）。
来源：丁香实验
