样本收集与免疫组化/免疫荧光染色
鉴定并定位人胎儿睾丸和附睾中的免疫细胞亚群（CD45+白细胞、CD68+巨噬细胞、CD3+ T细胞、CD66b+中性粒细胞、类胰蛋白酶+/糜酶+肥大细胞）。
使用20例GW14-41的胎儿睾丸（及附睾）石蜡切片，进行IHC和IF染色，使用特异性抗体（表1），并通过明场和荧光显微镜观察，结合DAPI和laminin共染以显示组织结构。
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人胎儿睾丸发育过程中免疫细胞群的定位
Localisation of immune cell populations during human fetal testicular development
实验完整度
高结合免疫组化/免疫荧光（20例胎儿样本）和公开scRNA-seq数据（GW6-16）两个证据层级，包含功能验证（如巨噬细胞在索旁分布）和机制探讨（如免疫细胞起源）。
主要模型
人胎儿睾丸组织（GW14-41） 人胎儿附睾组织（存在时） 公开scRNA-seq数据（人胚胎和胎儿睾丸，GW6-16）
重点核对
样本孕周范围：GW14-41，具体分布为GW14/15-20 (n=8), GW21-24 (n=8), GW25 (n=3), GW33-34 (n=3), GW41 (n=1) 固定方式：4% PFA固定 抗体克隆和稀释度（见表1，如CD68克隆PG-M1, 1:250） scRNA-seq数据来源：GEO accession GSE143356 阴性对照：省略一抗
摘要
本研究探讨了人胎儿睾丸中免疫细胞及其起源的有限知识。通过鉴定和定位巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞和肥大细胞，为其在睾丸和附睾发育中的潜在作用提供了证据。通过免疫组织化学和免疫荧光法，在20例尸检死产胎儿（孕周14-41周）收集的福尔马林固定胎儿睾丸（以及存在时的附睾）中鉴定出巨噬细胞（CD68+）、T细胞（CD3+）、中性粒细胞（CD66b+）和肥大细胞（类胰蛋白酶+和糜酶+）。从已发表的人胚胎（GW6-8）和胎儿（GW12-16）睾丸scRNA-seq数据集中汇编了免疫细胞转录本。CD68+巨噬细胞在间质、睾丸边界和血管周围区域丰富，从GW23起在索旁增加。间质CD3+ T细胞在孕中期罕见，但在孕晚期更常见。CD66b+中性粒细胞极为罕见。糜酶+肥大细胞缺失，而类胰蛋白酶+肥大细胞存在于被膜和血管附近。scRNA-seq鉴定出表达CD68的细胞是GW6-16期间主要的免疫群体。这项对人胎儿睾丸中多种免疫细胞类型的首次描述揭示了与小鼠睾丸的相似性；在这两个物种中，早期巨噬细胞的丰度先于骨髓造血，提示其起源于卵黄囊和/或肝脏，而后期出现的免疫细胞可能源自骨髓。晚期妊娠阶段Ly6G+中性粒细胞几乎完全缺失，这与小鼠的观察结果不同。这些发现突出了易受免疫相关破坏影响的发育窗口，并强调了小鼠模型对于理解人类睾丸发育的价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人胎儿睾丸发育过程中，免疫细胞（特别是巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞和肥大细胞）的出现时间、定位和可能的起源是什么？
- 核心机制
- 巨噬细胞是人胎儿睾丸中最主要的免疫细胞，可能通过参与细胞外基质重塑和与体细胞/生殖细胞相互作用来支持睾丸发育；早期巨噬细胞可能来源于卵黄囊或胎肝，后期免疫细胞可能来自骨髓。
- 主要证据
- 免疫组化/免疫荧光显示CD68+巨噬细胞在间质、血管周围和索旁丰富，且从GW23起增加；scRNA-seq显示CD68+细胞是GW6-16的主要免疫群体，且高表达HLA-DR和CD14，低表达CD80/CD86，提示其抗原呈递功能可能尚未成熟。
- 研究意义
- 本研究首次系统描述了人胎儿睾丸中多种免疫细胞的定位和转录特征，为理解免疫细胞在睾丸发育和男性生育中的作用提供了框架，并强调了小鼠模型在相关研究中的价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
scRNA-seq数据处理与免疫细胞转录分析
利用公开scRNA-seq数据（GW6-16）分析免疫细胞的转录特征和发育轨迹。
从GEO（GSE143356）获取Guo等（2021）的10X Chromium数据，使用Seurat包进行聚类和UMAP分析，提取免疫细胞相关标记基因的表达谱。
结果整合与比较
将蛋白水平（IHC/IF）与转录水平（scRNA-seq）的结果进行整合，比较不同孕周免疫细胞群的变化，并与小鼠数据比较，推断免疫细胞的起源和潜在功能。
对比IHC/IF和scRNA-seq数据中免疫细胞标记的表达，分析巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞和肥大细胞在不同发育阶段的丰度和分布，并讨论其可能的发育起源和功能意义。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学/免疫荧光 | 抗CD45抗体 | DAKO | M0701 |
| 抗CD3抗体 | DAKO | 0452 | |
| 抗CD68抗体 | DAKO | M0876 | |
| 抗类胰蛋白酶抗体（DAKO） | DAKO | 7052 | |
| 抗类胰蛋白酶抗体（Abcam） | Abcam | Ab2378 | |
| 抗糜酶抗体 | Abcam | Ab233103 | |
| 抗CD66b抗体 | BioLegend | G10F5 | |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| 兔抗鼠生物素化二抗 | DAKO | E0468 | |
| 山羊抗小鼠HRP偶联二抗 | Dianova | 115-035-003 | |
| 免疫荧光 | 驴抗兔Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A21202 |
| 驴抗小鼠Alexa Fluor 555二抗 | Invitrogen | A31572 | |
| 免疫组织化学 | Vectastain Elite ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| DAB显色液 | Agilent Technologies | -- | |
| DPX封片剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI染液 | Invitrogen | D3571 |
| ProLong Gold封片剂 | Invitrogen | -- | |
| 免疫组织化学 | 柠檬酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 过氧化氢 | Merck Millipore | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 驴正常血清 | -- | -- |
| 图像采集 | 奥林巴斯VS120切片扫描仪 | Olympus Life Science | -- |
| 图像分析 | OlyVIA软件 | Olympus Life Science | 2.9.1 |
| scRNA-seq分析 | Seurat（R包） | -- | v4.0 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 样本来源：大学萨格勒布医学院组织学与胚胎学系和哥本哈根大学医院；孕周范围和样本量（GW14/15-20 n=8, GW21-24 n=8, GW25 n=3, GW33-34 n=3, GW41 n=1）；固定方式：4% PFA 阅读提示：Materials and methods - Samples |
| 免疫组织化学/免疫荧光 | 抗体克隆和稀释度（表1）；抗原修复条件（柠檬酸盐缓冲液pH 6.0）；阻断条件（5% BSA）；一抗孵育（4°C过夜）；二抗孵育（RT 1h）；检测系统（Vectastain Elite ABC kit和DAB） 阅读提示：Materials and methods - Immunohistochemistry, Immunofluorescence, Table 1 |
| scRNA-seq数据分析 | 数据来源：GEO accession GSE143356；样本孕周：GW6-8, 12, 15, 16；分析软件：Seurat v4.0；聚类参数：基于显著主成分 阅读提示：Materials and methods - Cell type identification and clustering using Seurat |
| 免疫细胞分类 | 分类标准：基于细胞大小、核形态和标志物；定位分类：‘border’和‘inner area’，更细分为间质、睾丸周边、血管内、索周、索内 阅读提示：Materials and methods - Imaging and morphometric analysis |