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问
荧光定量pcr遇到的问题,求助
Bumihiko
一般来说影响不大的,既然说明书写30s已经足够的话,就没必要用60s那么长时间,不过用了60s结果应该也会差不多
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问
PCR跑胶条带还可以,切胶回收浓度是负的.
balalaLy
回收试剂盒试剂有没有弄混,溶胶的过程胶有没有完全溶解,回收最后一步建议用50度左右的buffer溶解产物,可以加大产物得率
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问
求大神给分析一下pcr失败的原因
dxy_g9y5gije
考虑三个方面第一是DNA,内参基因验证第二是TM值,设置温度梯度第三是引物,多试几条引物挨着验证
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问
如何判断pcr样本是否污染,怎么避免?
dxy_g9y5gije
pcr样本污染是指模板污染还是整个体系污染呢如果是体系,那么做好阴性克隆和阳性克隆就可以判断如果是模板的话,考虑重新获取模板比对
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问
做了三次qpcr独立重复,前两次都有相同趋势,第三次出现了严重反差,实验过程是没问题的操作也很严谨,这种情况要怎么办呢
dxy_g9y5gije
遇到这种情况建议详细记录实验过程再次尝试,因为导致这种结果出现的情况太多了,需要逐一排除
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问
当PCR产物有两条带的时候,怎么才能快速提高特异性?
Miracle星
出现多条条带表示PCR反应的特异性不高,可以进行如下优化尝试:1.适当提高PCR的退火温度。退火温度越高,DNA分子之间的配对越困难。这样可以减少引物与模板之间非特异性的结合。2.检查一下引物的Tm值和序列结构,如果引物Tm值过高,上下游引物Tm值相差太大,或者引物单链易形成高级结构,都不利于PCR反应。必要时重新设计引物。3.检查一下模板纯否。模板越纯,条带越特异。反之模板杂乱(例如cDNA文库
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问
我是要扩增一个片段,加上双酶切位点,片段就那么大,我就需要那么大加酶切位点?这引物怎么设计?是不是只要5‘端序列,以及3’端的反
dxy_j7jezao0
5'端加上酶切位点不影响你扩增目的片段,网上用软件设计可以直观作出对引物的评价。你也可以自己设计,符合一些引物设计原则就好
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问
普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别
dxy_j7jezao0
qPCR为保证扩增效率,产物片段较小,70-250bp,TM值一般60左右其他差别较小
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问
请问 PCR引物长度24点情况下,错配几个碱基仍能P出来、基本不影响效率?
dxy_j7jezao0
不确定,引物特异性主要受3'端序列影响,错配在5'端,影响较小。
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问
如何针对致泻性大肠ETEC的stp和sth基因设计特异性强且有效的引物和Taqman探针?能够使Ct值小一点,荧光强度值大一点
Miracle星
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2、引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近,一般Tm值不超过5℃。3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间,最好为72℃左右。4、引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修
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问
融合蛋白之间,可用两个酶切位点代替linker吗?
Miracle星
不可以的简单的说:1.要遵循引物设计的基本原则,,重组表达的引物相对容易设计一点(因为位置固定); 2.目的产物是:蛋白1+linker+蛋白2,则需插入载体的目的片段为“酶切位点1+蛋白1+linker+蛋白2+酶切位点2”3.那么想获得这个目的基因片段,则需要设计4个引物,分两步进行。1)引物:P1——> 5'- 内切酶1+蛋白1上游 -3' (正向序列)
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问
免疫共沉淀实验,总是假阳性,该如何避免
天一湖医者
免疫沉淀的假阳性一般來自洗过的免疫沉淀物中存在的某些蛋白质,这些污染物在完整细胞内不与目的蛋白相互结合,但在细胞裂解后可形成非生理条件的蛋白质与蛋白质的相互作用,也可能来自抗体与其他非目的蛋白的交叉反应,(这在做western很常见),或者非特异性反应.为了排除这种假阳性可采用几种方法:一是采用几种不同抗体.如用几种不同的cmyc抗体去IP,可增加结果的可信度,另外也可以采用对照抗体,如与你的抗体
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CFW荧光染色染尖孢镰刀菌菌丝染不上怎么办?
bamboopiggy
是不是你的溶液A失效了?你试试延长一下溶液A染色的时间?增加到2min试试
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用0.3%戊巴比妥钠麻醉小鼠,给药体积0.1-0.2ml/10g,剂量为多少mg/kg?
天一湖医者
用0.3%戊巴比妥钠麻醉小鼠,给药体积0.1-0.2ml/10g,剂量一般是40mg/kg左右.
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病毒传代细胞培养中,每次传代都需要PCR检测病毒浓度吗?还是说每隔几代检测一下就可以
Miracle星
为了数据更加严谨,建议每一代都检测一下病毒浓度,自己也可以记录对比!更有说服力
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如果想检测淋巴结或者脾脏的细胞因子,有什么合适的方法吗?
balalaLy
组织消化成单细胞流式检测蛋白表达切片免疫组织化学染色检测蛋白表达组织裂解提蛋白wb、elisa测蛋白提rna pcr检测
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求助:关于医学免疫学抗原的知识
Miracle星
根据抗原刺激机体产生抗体时是否需要Th细胞辅助而将抗原分成两类:胸腺依赖性抗原(thymus dependant antigen,TD-Ag)和胸腺非依赖性抗原(thymus independent antigen,TI-Ag)。TD-Ag是指在刺激机体B细胞产生抗体时需Th细胞辅助的抗原。B细胞通过BCR识别抗原的B细胞表位,内吞并将抗原降解成短肽,通过与MHC Ⅱ类分子结合,提呈给Th细胞识别
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问
请求专业人士解答内含子lncRNA
Miracle星
lncRNA 的生物功能lncRNA作用范围广泛,机制非常复杂,为了方便大家的理解,我们来简单看看lncRNA的特点:1. 在编码蛋白基因的上游启动子区转录,干扰邻近蛋白编码基因的表达2. 与编码蛋白基因的转录本形成互补双链,调控基因的表达水平3. 结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性4. 作为小分子RNA的前体分子或者miRNA反义抑制分子5. 作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体lncRN
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基因敲除后验证问题。
天一湖医者
首先你要考虑,你所加的抗性浓度是否足够,在你要做的细菌中的抗性浓度与所使用的浓度不是一致的。其次,你的自杀载体真的进去了吗,电转真的转化进去了。再者你要双交换或者单交换的同源区有多大呢,不同菌对同源区要求很不一样;
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药物处理后流式测凋亡
Miracle星
首先你调整一下吹的程度,就是把之前的力度减小一些,试试再做一次对比一下,然后你再用不同的浓度再改变重新做一下。这样就知道到底是什么原因了。
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