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问
请问普通PCR和RT-qPCR大家都做吗?还是只做一种,如果两个实验结果对不上怎么办?
天一湖医者
实时定量PCR和半定量PCR结果不相同很正常,毕竟半定量PCR的误差很大,在做半定量的时候,你一定要把内参基因调的,在各个组织中表达量是一样的,这样才能做目的基因。而实时定量PCR就不存在这样的问题,所以我觉得还是你的半定量可能调的cDNA没有调好。
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问
提取质粒,但是再次用通用引物电泳验证时,在最上方跑出一条条带,请问是为什么呢?
天一湖医者
做酶切了么?如果抽出来没有酶切因为质粒的不同构型,会看到不同的条带。如果抽完质粒再做一个单酶切,得到的就是线性的条带,就只有一条了。
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问
qPCR引物连续四个G或者自我互补分数太高可以用吗?
天一湖医者
可以用,但也不要太高,否则不利Taq 酶的催化反应。
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问
构建载体一直构建不上,可咋整?
天一湖医者
1.确保克隆到的基因完全正确:如果这一步出问题,无非两点原因:引物设计不合理,模板质量不高。解决方法:多找几个模板同时进行克隆;重新评估引物的合理性和特异性,比如将引物长度增至40 bp左右。2.关于酶切酶切其实要求并不十分严格,正常操作下,不论电泳检测是否十分清楚,酶切产物足够连接用量了,没必要纠结。
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问
DNA抽提后浓度稀释问题
天一湖医者
浓度20ng/ul以上足够了,如果用的是组织提取,浓度一般很高,可以达到几百甚至几千。如果你用的是病毒、少量细胞,浓度低一些也没有关系。
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问
RNA抽提方法的比较
汤姆卜丽波
Trizol就是准备和提取上比较复杂,但其实提好了效果会比试剂盒好一点
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问
WB实验添加蛋白的量多少?
天一湖医者
Western blot实验中,蛋白上样没有特别固定的含量标准的。如果按照单一条带印染效果好来说的话,蛋白上样一般含量2~5微克就可以了。如果是表达提取总蛋白的话,为了让目的条带能够被检测到,总蛋白量可以提高一些,10~20微克都可以的。
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问
菌液PCR全假阳性,咋回事
cab2
可以先用cracking液裂解细菌,然后菌液跑胶看质粒大小
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问
载体构建时遇到了问题
汤姆卜丽波
这应该是酶切位点不太对,没有在产物头尾,在产物中间
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问
构敲降质粒,测序结果比对,两个酶切位点和载体序列都对上了,只有合成的敲降序列后半段不对 。是单链退火有问题还是公司合成的序列不对
天一湖医者
序列的方向需要验证,因为TA是随机插入到载体里面的。所以先用一个载体引物和你的insert引物配对检测得到正确方向插入的clones。
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问
co-ip igg组出现和目标条带相同位置 相同强度的条带,怀疑是igg或者磁珠结合了目的蛋白,更换igg可以吗?
汤姆卜丽波
可以啊,本来就应该是和ip同源的
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问
细胞培养中如果染菌了,会对CCK-8的测量结果产生什么影响
汤姆卜丽波
如果细胞被污染了那整体吸光度肯定会变
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问
【求助】2型糖尿病小鼠成模标准
汤姆卜丽波
葡萄糖耐量测试(OGTT)比空腹血糖监测更有诊断意义:实验前禁食12h,用20%葡萄糖溶液(2g/kg)灌胃,于空腹、服糖后30、60和120min定时鼠尾采血测定血清葡萄糖含量,空腹血糖高于7.00mmol/L,和试验后2小时内随机血糖高于11.10mmol/L即为糖尿病
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问
铁死亡中用亚铁你们用的是什么呢?以及怎么配置的吖?
bamboopiggy
可以用硫酸亚铁铵来处理细胞,参考:Nano-targeted induction of dual ferroptotic mechanisms eradicates high-risk neuroblastoma 最大用到了600uM
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问
卵巢组织如何提取巨噬细胞?
bamboopiggy
将组织研磨成单细胞悬液,然后用CD68标记巨噬细胞M,φCD163标记M2,进行流式分选
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问
有没有人有RIG-I(DDX58)这个基因的过表达载体呀?
汤姆卜丽波
这个还是找公司设计,自己做起来很麻烦,或者你们课题组有做这个的,也可以问问
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问
小鼠小胶质细胞BV2从公司买回来复苏以后,细胞长了伪足,用的Gibco的血清和BBI的DMEM培养基养的,它还能长成圆形吗?
汤姆卜丽波
伪足也有可能是正常的吞噬连接其他细胞的状态。再养两天看看
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问
肺上皮细胞HBE在逐渐传代的过程中细胞失去形态
汤姆卜丽波
可能是消化的太狠了,或者就是细胞老化了
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问
求问大家这个细胞是什么污染,哭了哭了,都没法做实验了
汤姆卜丽波
与细胞共存的污染物,多半是支原体
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问
NF-kB的激活验证
balalaLy
核浆分离提取蛋白,比较核内外蛋白量,提取总蛋白比较磷酸化和非磷酸化
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