如何针对致泻性大肠ETEC的stp和sth基因设计特异性强且有效的引物和Taqman探针？能够使Ct值小一点，荧光强度值大一点

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过5℃。

3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为72℃左右。

4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰，且 3’端的碱基一般不用A；引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

6、尽量在基因的编码区（CDS序列）上设计引物，限制基因组DNA扩增。

7、使用BLAST检索，确认引物特异性。