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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
请问用脂肪肝样品跑wb如何把脂肪清理的干净一些?目前跑出来的感觉样品不纯
小布丁瑶瑶
1.尽可能的削掉不需要的脂肪组织2.调整组织块的方向使脂肪最后接触刀片3.保证刀片、台面的干净及组织块的冷冻程度
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问
请问在在western blot过程中的高温变性是必须的吗?什么情况需要变性?什么情况不需要变性?如何避免磷酸化蛋白的降解?
府宅
不一定。要低温操作:室温条件下,磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。请勿反复冻融,操作时一定置于冰上。加入抑制剂:组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶,它会导致磷酸化蛋白的去磷酸化,因此,必须在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂。
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问
请问western显影的时候条带偏离目标分子量较远,但是只有一个条带是什么原因?如何判断是不是目的蛋白?
府宅
有一下原因造成偏离。可以进行免疫肽封闭实验确定是否是目的蛋白。
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问
提取同一批小鼠肠道组织蛋白,蛋白浓度都不低,为了调整上样量,都调整了浓度,为什么有些样品连actin 都跑不出来?
颜渊溪桥
肠道组织属于平滑肌,用b actin坐内参不合适,换个内参gapdh试一下
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问
提取的蛋白保存后没有凝固呈水状的原因
是小杨同学
我觉得有可能是污染了,或者是冰箱温度的问题,建议放在-80°C冻存呢
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问
关于-80度冻存组织的核蛋白提取的问题
小布丁瑶瑶
可以的,结果可能会不同,减少-80度的时间,结果应该会更相近一些
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问
提取的组蛋白Histone3怎么定量?
dxy_h7vcp8v3
首先检测内参的抗体和你自己目的蛋白是不一样的,从内参和目的蛋白WB来看,说明你自己的蛋白胶及转膜体系都没有问题。就应该在不同的地方找原因,其一检查目的蛋白的抗体是否过期或者长杂菌 ;其二,检查目的蛋白提取所用buffer是否调节至中性PH值,是否其中缓冲液让蛋白质变性导致没有条带 ;其三建议检查下,自己第一次提出来呢过程中的关键试剂,是否在后边提取中做了更换,检查更换的试剂是否正确。
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问
贴壁细胞蛋白提取相关问题
ZZDX-YILILI
1.首先你的这个方法从哪得到的我不是很清楚哈,根据我的经验,你这个4℃一小时时间相对就挺长的了,有可能会造成蛋白质降解。2.细胞系的话,一般冰上或者4℃裂解30分钟就足够了。3.裂解液的话,我一般用的是购买的RIPA,你这个tritonX裂解能力对细胞系应该太强了,尽量换下相对温和的裂解液。
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BCA测蛋白浓度相关问题
隔壁家的小夜猫子
确定你每个点都在标曲信任范围内么,另外稀释的时候取液太小不容易取准,建议梯度稀释。
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问
包涵体的纯化相关问题
dxyhsx123
先破菌,去上清,在洗涤,再用尿素溶解。一些浓度和时间,根据实验进行摸索。
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问
蛋白切割PH调节相关问题
一支肾上腺素
如果提高溶液的PH值,那么就要在溶液中加入大于这个PH的溶液;如果要降低溶液的PH值,那么可以加入小于这个溶液PH的溶液。在调节溶液PH的过程中,应该随时监测溶液PH的变化。
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问
重组蛋白表达的目的蛋白分子量小于预测的原因?
dxy_e0cuvey7
呜呜呜 有没有找到原因和解决办法呀呀?我的也一样少了10kd
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问
链霉亲和素融合蛋白的离子交换纯化相关问题
是小杨同学
我觉得可能标签有点问题呢,可以换一个标签试一下,或者我觉得可以在蛋白与标签之间加一个酶切位点,在过离子交换之前把标签给切掉
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问
蛋白质在透析过程中有大量沉淀的原因?
是小杨同学
有可能是因为PH值,温度等引起的沉淀,也有可能是蛋白本身就不太稳定容易沉淀,可以超声或梯度透析试试看
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问
sumo蛋白酶切不开带sumo标签的蛋白的原因?
dxy_d4xj2yg7
1. SUMO酶活性不佳,加对照蛋白验证酶活性有没有问题。2. 有可能是蛋白结构问题,标签的结构可能不正确,酶无法识别标签。可以考虑换个其他标签,比如EK,3C等。
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问
重组蛋白用于体外细胞培养时内毒素标准相关问题
JCorona
1.内毒素对细胞是有影响的,尤其是免疫相关的细胞,例如RAW264.7;2.一般推荐内毒素的浓度低于5EU/mL
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问
His tag蛋白镊柱纯化速度太慢是什么原因?
红格子一号
样本离心不彻底细胞碎片太多了导致堵了柱子
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问
纯化方法相关问题
一支肾上腺素
一定要记住56℃30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。如果温度过高,时间过久或摇晃不均匀都会导致沉淀物的增多。
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K48、K63泛素蛋白质粒表达出来的泛素有何不同?
lzy必有我师
K48就是一般设计目标蛋白的降解,连接仍然是细胞通过蛋白水解降解维持体内平衡的关键途径最远端的泛素第48位赖氨酸被精氨酸取代,限制链长。 K63连接的多泛素化修饰蛋白质已经涉及DNA损伤反应的调节,内体分选,蛋白质错误折叠/聚集的自噬等细胞过程和神经退行性病变。这些四泛素链是由野生型泛素的酶促连接产生的。最远端的泛素含有精氨酸取代赖氨酸第63位,限制链长K63一般涉及翻译后修饰的功能获得或者失活。
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问
要送LC/MS液相色谱-质谱检测的co-IP胶条,操作全程注意事项?
一支肾上腺素
注意安全,有些试剂毒性很大,特别是后面处理,每一步都要小心注意。
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