贴壁细胞蛋白提取相关问题
丁香实验
想问下大家普通贴壁细胞加药后，是用什么提的呢，我提全蛋白，用自己配的裂解液，里面有1%的Triton，然后在转染40小时后加药，8小时候收细胞，用PBS冲洗一遍，然后加裂解液，用刮刀刮下来，4度摇一个小时，然后离心13000g，30min，取上清分装。想问下有没有大神知道这样提蛋白的话会导致蛋白降解吗
17 个回答
dxy_qkedgrg7
有帮助
你的操作方法确实不太好，时间太长了，提蛋白要尽量时间短，并且都在冰上操作，我们实验室都是买的RIPA再加各种蛋白酶抑制剂后提的，一般4度离心12000rpm，15min就可以了
dxy_h7vcp8v3
有帮助
贴壁的蛋白质提取，刮刀那一步可以使用大枪吧样品用buffer吹下来，在蛋白提取过程中不要涉及让蛋白质变性或者沉淀的剧烈操作或者变性剂。最后，怕蛋白质降解的话，尽量快速提取，冰上操作，最后液氮速冻。
jey1235
有帮助
首先Triton的裂解可能过于强烈。当然也看triton的浓度。建议去买商业化的Kit，有面向不同用途的。
你的操作原则上没有问题，建议上清需要加入一些甘油分装，防止冻融带来的物理损伤。
ZZDX-YILILI
有帮助
1.首先你的这个方法从哪得到的我不是很清楚哈，根据我的经验，你这个4℃一小时时间相对就挺长的了，有可能会造成蛋白质降解。
2.细胞系的话，一般冰上或者4℃裂解30分钟就足够了。
3.裂解液的话，我一般用的是购买的RIPA，你这个tritonX裂解能力对细胞系应该太强了，尽量换下相对温和的裂解液。
dxy_bq4uxnd
有帮助
这里面加蛋白抑制剂了吗？没有蛋白抑制剂很有可能会对蛋白产生影响，还有震荡1小时有点长了，半个小时足以。
此用户已注销
有帮助
你的裂解液得有蛋白酶抑制剂呀，而且离心要低温离心，时间15分钟就可以了
dxy_4uyyu09r
有帮助
我们实验室习惯用碧云天的试剂盒，他有好多种裂解液针对不同的组织或者细胞。然后加上蛋白抑制剂，直接按照说明书比例操作就行，没出过问题
小白野蛮成长
有帮助
我是用PBS刮下来 离心 加裂解液 涡旋 冰浴30min
隔壁家的小夜猫子
有帮助
怕降解就加MG132和蛋白酶抑制剂，怕裂解不充分就在转之前加一步条件不剧烈的超声，一般降解都出现在保存不当上，转一个小时问题不大。
Guoood
有帮助
不知道你4度摇一小时的目的是？只要在裂解蛋白的裂解液中加入蛋白酶抑制剂或者PMSF，在冰上或者4度放置一般不会那么快降解，但最好尽快分装蛋白变性放-80保存。
z流沙z
有帮助
只要加了蛋白酶抑制剂，并且全程在冰上裂解提取蛋白，基本不太会降解
dxy_w4oj7yoe
有帮助
加一些PMSF cocktail等蛋白酶抑制剂应该就不太容易降解了
dxy_pni5ki46
有帮助
加蛋白酶抑制剂的话问题不大，不过提取全蛋白我们一般还会超声一下，有时候会有一些dna结合的蛋白不超声做不好
verbalkint
有帮助
应该不会降解，不过刮刀刮下来之后吹匀就行，不用在四度晃，这样可以尽快冻存，尽可能避免降解
飞天幻雪
有帮助
会降解。没必要自己配置裂解液。现在国产非常便宜的而且一定要买配套的蛋白酶抑制剂，根据实验目的，选择合适的抑制剂能够最大化减少降解问题。而且4℃一小时时间太长了，没必要
vae1476
有帮助
4度摇一小时的步骤跟我了解的不太一样，一般来说是剧烈震荡啊，当然如果蛋白不太稳定，需要更温和的操作以及加入防降解试剂
bamboopiggy
有帮助
可以的，只要在操作中注意放冰上，低温操作没问题的
相关产品推荐
相关问答
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
提问
扫一扫
实验小助手
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序