请问在在western blot过程中的高温变性是必须的吗？什么情况需要变性？什么情况不需要变性？如何避免磷酸化蛋白的降解？

不一定。

要低温操作：室温条件下，磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。请勿反复冻融，操作时一定置于冰上。

加入抑制剂：组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它会导致磷酸化蛋白的去磷酸化，因此，必须在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂。

不一定要变性。
取决于选择的抗体识别的表位是什么样的。有些抗体会标明验证过哪些实验，例如WB，ELISA等，如果标有ELISA，IHC之类的，说明抗体可以识别天然状态下的蛋白，不用变性也可以检测。
但是如果抗体只标注做过WB就需要当心，因为很可能这个抗体只能检测到变性以后的线性表位，如果蛋白没有变性，有高级结构，就有可能检测不到。

不一定需要变性，取决于抗体的识别的表位。若抗体识别的是一级结构，则蛋白需要变性，若抗体识别的是二级结构甚至三级，则不需要变性。此时要注意使用非变性胶。避免磷酸化蛋白的降解需要全程在低温操作，且加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂