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        His tag蛋白镊柱纯化速度太慢是什么原因?

        相关实验:蛋白质的表达、分离、纯化实验

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        丁香实验

        His tag蛋白镊柱纯化速度太慢(30秒左右一滴)是什么原因?

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        27 个回答

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        红格子一号

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        样本离心不彻底细胞碎片太多了导致堵了柱子
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        是小杨同学

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        我觉得可能是杂质有点多然后柱子堵住了,或者是蛋白中杂带有点多哦
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        dxyhsx123

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        个人认为应该是样本没有纯化好,杂质太多,柱子有点堵了。
        user-title

        z流沙z

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        柱子填充过多,或者样品离心不够或者吸到沉淀导致大分子较多,或者样品浓度较高
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        lzy必有我师

        有帮助
        变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点,而通过洗脱液无法彻底清洗所致
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        医往情深丁香园

        有帮助
        离心不够实,有沉淀,蛋白浓度太高(增加lysis含量);
        user-title

        dxy_bq4uxnd

        有帮助
        可能是超声破碎的不彻底,导致大分子的物质堵塞了整个柱子,建议超声功率与时间进行调整,充分离心,减少杂质后试试。
        user-title

        JCorona

        有帮助
        可能的原因:1.色谱柱堵塞;2.填料过多;3.样品粘稠
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        一支肾上腺素

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        蛋白可能沉淀到柱子内部了,尝试降低上样量避免蛋白沉淀。
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        内科小护士

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        可能原因,逐渐积累沉淀,变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点,而通过洗脱液无法彻底清洗所致
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        zxb597

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        使用过程中发现堵塞严重,且流速越来越慢 样品粘稠度高。
        user-title

        dxy_h7vcp8v3

        有帮助
        其一,可能是因为蛋白上清离心不彻底,杂质太多。建议充分离心例如15000g 30_60min;也可以对上清液进行过滤然后过纯化柱 ;其二,可能是柱材重复使用,柱材里堆积杂质太多,建议柱材重生再次使用:其三,可能是承载柱材的垫片,被杂质堵住。建议,加柱材之前,在流水下冲洗几次,看到水流通畅后在加柱材进行后续实验。
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        ZZDX-YILILI

        有帮助
        1.有可能是柱子堵住了,建议用缓冲液多冲洗几次。 2.如果确定柱子没有问题,有可能是蛋白液体粘度太大,或者蛋白析出或者变性。 3.还有可能蛋白中杂带较多,目的蛋白含量小,使得杂蛋白过多结合柱子造成堵塞。
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        dxywode

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        唑环结合而把蛋白结合下来的,这种结合里相对较弱,一般来讲,在过柱子的过程中有很多NI只与组氨酸标签中的一部分咪唑环结合,所以在这种情况下如果流速过快会阻碍他们进一步的结合,另外,流速过快大大缩短了NI与咪唑环结合的时间,减低了结合几率。
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        jey1235

        有帮助
        这个问题哦以前经常遇到,我总结一下几点: 1、上清务必要高速离心(18000g)30min以上,去掉沉淀 2、针对大肠杆菌表达,1L OD0.6菌最少50ml buffer重悬,昆虫可以少一些 3、有条件,上清加一些核酸酶,消化基因组。如果的柱子发黄就是这个原因 4、其次Ni柱最好5次使用以上务必再生而不是清洗,去掉所有粘附的蛋白 5、不建议加压力硬推,柱子用完要保存在20%EtOH
        user-title

        dxy_pni5ki46

        有帮助
        是重力柱吗,不知道样品上样前有没有离心过滤膜,样品是否粘度大,还有可能缓冲液不合适蛋白发生变性堵柱。重力柱本身也比用蠕动泵或者akta慢。
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        dxy_4uyyu09r

        有帮助
        首先是不是上次用完,,没洗干净啊?残留太多会影响到,其次上样量不能太多,可以稀释一下,少加。或者换新柱子,还有ph缓冲液都可以优化
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        Guoood

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        首先用5倍柱子体积纯水清洗柱子,排尽空气。其次有可能是镍柱中有残余的蛋白,可考虑用盐酸胍或buffer处理一下应该会缓解;如果还是不太好用,可以再生镍柱。
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        bamboopiggy

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        柱子是买的还是自己灌的?如果是买的,就是你的穿通液里面杂质太多,在上柱之前用0.45的滤器过滤。自己灌的柱子的话,看有没有气泡
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        神经蛙1本

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        可能是柱用太久了,堵塞了,纯化慢,而且纯化出来的蛋白量少。
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