链霉亲和素融合蛋白的离子交换纯化相关问题
丁香实验
我把融合蛋白表达出来过离子交换层析以后，不管是流穿液还是所有对应的蛋白峰里面都没有我的目的蛋白，（但是做离子交换之前是有的）离子交换过程应该是没有什么问题的，我就是在想是不是这个标签对离子交换造成了影响？
26 个回答
是小杨同学
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我觉得可能标签有点问题呢，可以换一个标签试一下，或者我觉得可以在蛋白与标签之间加一个酶切位点，在过离子交换之前把标签给切掉
lzy必有我师
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1、标签有可能对这个蛋白质造成影响使得离子交换基团无法结合2、确定下做离子交换的介质是否合适，比如阴离子或者阳离子等。3、还有洗脱蛋白质的缓冲液PH等是否合适 4、试试亲和层次是否可行。
dxyhsx123
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首先更换一个标签后在进行实验，进行验证。其次过柱的一些步骤和速度也要确认。
z流沙z
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标签表达说不一定有没有影响，可以考虑换一个标签，另外标签在目的蛋白前后也有影响
内科小护士
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如果是标签问题的话，那就换一个标签，或者在蛋白与标签之间加个酶切位点，过离子交换之前把的切掉。
JCorona
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怀疑标签问题的话，可以试试换标签或者酶切标签后对比。排除标签的问题后，还可能是洗脱的问题。
医往情深丁香园
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柱子的缓冲液还有清洗都要确保没问题，标签的话只要选择的合适的问题不大，不过也可以尝试换一个。
dxy_qkedgrg7
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可能是标签有问题，可以换个其他的标签试一下
vae1476
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应该不会是标签对离子交换产生的影响，实在怀疑可以做酶切，把酶切前后的，做个对比
dxy_f107rkjq
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查一下相应蛋白的pI值，看看离子交换的梯度设置是否有问题。梯度完了用100%B或者A（根据选择的离子交换柱类型决定）冲洗，把样品都收集，看看是不是梯度设置问题
ZZDX-YILILI
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1.确定下做离子交换的介质是否合适，比如阴离子或者阳离子等。还有洗脱蛋白质的缓冲液PH等是否合适。
2.标签有可能对这个蛋白质造成影响使得离子交换基团无法结合。
3.既然带了链酶亲和素标签，试试亲和层次是否可行。
dxy_bq4uxnd
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标签一般不会对离子交换产生影响，如果之前做离子交换有，现在没有，建议利用酶把标签剪切掉。
一支肾上腺素
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可能原因：超声的功率不对( 太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)解决方法：改变超声功率或超声前。
dxy_h7vcp8v3
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检查离子交换前蛋白的浓度是否足够，如果太低则实验结束收集不到蛋白。建议，增加蛋白浓度；检查离子交换过程中buffer的ph值，是否中性，过程中没有使蛋白质变性。
dxywode
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通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列（fusion tag）的3’末端，比如大肠杆菌的一段序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白以及硫氧还蛋白（Trx）融合蛋白等。
dxy_pni5ki46
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链霉亲和素融合蛋白的话用生物素偶联的琼脂糖纯化好一点吧。流穿和洗脱蛋白峰都没有目的蛋白的话我觉得可能是离子交换过程中蛋白收到破坏降解，最后洗脱的是链霉亲和素，还有可能蛋白变性沉淀在柱子上
jey1235
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这种情况要考虑是不是蛋白全部挂在了离子柱上。
如果inject的样品确定是有目标蛋白，要考虑是不是盐浓度的快速变化导致样品来不及洗脱而直接沉积在离子柱上。
可以采用2M NaOH （浓度按说明书推荐，我一般用2M）直接冲洗，然后看一下有没有蛋白。
zxb597
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选择阴离子介质且操作的pH不符，流速太高
蛋白质被蛋白酶降解
Guoood
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离子交换层析的是通过不同条件pH洗脱来达到分离蛋白的目的，标签不太可能会影响到离子交换洗脱，可以尝试用不同pH溶液进行洗脱。或者融合蛋白富集还可通过标签树脂大量纯化的方法来实现！
dxy_4uyyu09r
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做离子交换以前的量多吗？有可能是纯化的时候损失掉了，另外柱子的缓冲液还有清洗都要确保没问问题。。标签的话只要选择的合适的问题不大，不过也可以尝试换一个。
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