实验问答21,944,875 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问同样的样品同样的上样量上了八个，最后条带从左到右颜色大小逐渐降低，不是一样的，为什么

whilt-shirt

有可能是转膜时没夹紧，或者是不是一抗二抗敷育时没放平

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问请问WB电泳时跑成这样是为什么

天一湖医者

可能是蛋白量太大，或一抗浓度和时间太长，可根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短

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问做WB用预置胶跑maker条带很挤

天一湖医者

电压太小了，或者可以用较小浓度的胶试试

3 回答1293 围观

问wb实验，条带和背景颜色都很深，虽然能区分，但是样子不好看，是什么原因？

dxy_91s7x0o6

可能原因：一抗稀释度不合适，一抗或二抗封闭温度高，洗膜不充分

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问WB用imageJ分析灰度值，灰色的峰是反的为什么？之前都正常。

110徐璐

打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先把条带弄正)

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问怎么提高wb结果重复性，并且让杂带少一点

110徐璐

内参稳定说明上样量稳定（应该大致是一样的），所以不存在什么上样量不一样的问题；出现这样的结果，问题出在每一步都有一定的可能性，比如电泳，转膜，敷抗体，显色等等。但据我所知，WB 最关键的还是转膜和敷抗体步骤，可能是你敷抗体的时候敷的不均匀。我的建议是你再认认真真，仔仔细细做几遍，很可能重复性就做出来了。只是个人观点。

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问我的α突触核蛋白为什么一直跑成这样

Amy_ldjm

请问你怎么跑出来的，一直跑不出来，要哭了。本人跑的方法上样25微克 80伏电泳maker跑开停止转膜280毫安 40分钟脱脂奶粉封闭1小时 TBST洗涤3次每次10min 一抗过夜就是没有条带感觉好难跑小分子

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问wb条带弥散怎么回事？

bamboopiggy

你说的是右侧的那一团黑色吗？不是弥散，是你加抗体的时候。不知道怎么把膜给弄伤了，出现非特异结合了。

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问整膜敷泛乙酰化抗体，显影70kDa marker那非常黑，求大神解答，感谢！

bamboopiggy

因为marker也是不同size的蛋白制成的mix，也会和抗体起反应，所以有黑色的条带，你用的是发光试剂显影吧？可能是你的蛋白浓度太高了，把辣根过氧化物酶给消耗干净了，所以反而没有光了，就泛白了

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问从左到右依次为input IgG IP组，这是不是没洗干净啊？我用PBS在垂直旋转仪上高速洗3遍每次10分钟。请问怎么解决？

bamboopiggy

是没洗干净，应该用你收细胞的的lysis洗，不是pbs洗。

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问没有目的条带，背景很干净是为啥？

JCorona

你是做WB吗？如果是的话，那么有可能：1.抗体失效或者特异度不够，导致无法与目的蛋白结合而催化发光；2.蛋白降解（可能是自然降解也可能是酶解），小肽段一来可能失去抗原表位，二来可能电泳时跑到胶外

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问WB有杂条带是是怎么回事？

JCorona

可能的原因：1.样品本身纯度不够；2.所用的溶剂（例如loading buffer）含有蛋白质污染；3.目的蛋白发生降解，杂带实际是目的蛋白的分解肽段

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问怎样提高Western Blot 的转膜效率？

辛勤劳动创造财富

浸泡PVDF膜5-10分钟，或者增加转膜时间，一定要注意散热，这很关键，冰融化了要及时更换。

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问WB杂带多怎么回事，做了好多次都是

迟C迟

.1.原因：细胞系传代次数过多，蛋白表达谱发生变化。建议：使用未传代或传代次数较少的细胞系（不超过15代）进行样品制备。 . 2 .原因：与细胞系裂解物相比，原代细胞或组织提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。建议：1. 用新鲜提取的，经过超声处理的澄清的组织提取物能降低背景。2. 同时，用去垢剂含量较高的RIPA buffer裂解组织，可得到裂解更彻底、一致性更高的裂解物。 . 3 .原因：蛋白

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问找不到蛋白抗体，可以用其他物种的同蛋白的多抗么？有没有什么办法可以检测出暂时没有抗体的特定物种蛋白的表达情况？

bamboopiggy

看你蛋白的保守性如何，如果保守性好，可以试试别的物种的抗体。对于没有特定抗体的蛋白，可以试试从rna水平先检测一下表达，跑个realtime pcr

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问WB内参总是不齐怎么办？

Lv花开花落

1.定量是否准。不知道题主实验室是用什么方法来进行蛋白定量。我们组是用蛋白标准品和标准曲线的方法进行定量。这种定量的方法要注意用的移液枪准不准（一个量程的话，每次加的都不准的现象要避免）；样品的浓度要在标准品画成的标准曲线中部；标准曲线的R方要大于0.99；枪头插紧，避免有气泡。配样品时要注意弹匀每个组分。2.跑胶过程中，如果移液器无法锁定量程的话，要看一下每一枪加的是否一样。3.选择一个适合自己

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问转膜的时候怎么判断有没有把目的蛋白转移到膜上？

未来9

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

5 回答628 围观

问WB条带每次曝光的时候条带边缘都有黑色的一圈是什么原因？

dxy_gwrp7ndq

第一建议用5%脱脂奶粉封闭，有条件的话封闭过夜，室温下至少封闭1小时。第二你一抗二抗稀释液应该都用含脱脂奶粉的来配，这样可以降低背景。第三这种现象我也遇到过，很可能是你一抗或二抗刚刚稀释之后，没有混均匀，然后就把膜放下去了。有的时候局部浓度特别大的时候，会造成严重的非特异性结合。第四洗膜不需要洗那么长时间的。一般洗3次，每次6~7分钟就可以了。敷完二抗之后洗3次，每次10分钟，

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问在样本制备和加样的过程中，所有会影响蛋白上样量的可能因素有哪些？如何提高蛋白上样量？

未来9

1、影响因素：样品浓度，蛋白裂解是否完全2、可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的，建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，以增大上样孔体积，可以试1.5mm厚的胶。

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问加药处理细胞，收集细胞提总蛋白跑WB，漂着的细胞要不要收集？收和不收对结果影响大吗？

米米米小喵

死细胞离心去掉，处理细胞时摸好条件，尽量不要让细胞死的太厉害，细胞增殖受到抑制的组可以少加点裂解液，方便调齐。

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