wb实验，条带和背景颜色都很深，虽然能区分，但是样子不好看，是什么原因？

原因很多。二抗的原因，内参是不是用的同样的二抗，如果是的，可以排除二抗的原因。抗体，样本，蛋白表达的情况都有可能

可能的原因及建议：

①膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。

②一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。

③ 一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。

④选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。

⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。

⑥检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。

可能原因：一抗稀释度不合适，一抗或二抗封闭温度高，洗膜不充分

是你抗体的特异性不好，但是如果你的条带确实很明显的话，你可以试试把洗膜液中的tween20改为千分之1.5，会洗的干净一些。

原因：

1.抗体的使用。一抗浓度过高是高背景的原因之一，且二抗也存在与封闭剂非特异性结合的可能，因此建议适当优化一抗浓度，并设二抗阴性对照；

2.曝光时间长。建议在实验中采用合适的曝光时间。

① 封闭不充分。背景过高的主要原因之一是封闭有问题，建议使用合适的封闭剂（脱脂奶粉、BSA 等），优化反应浓度与封闭时间，同时注意避免出现抗体与封闭剂的交叉反应，以及封闭剂与含有目标抗原，内源性生物素或者与抗生物素蛋白/链霉亲和素不相溶等问题；

② 洗膜不充分。适当增加洗膜次数和缓冲液体积，提高吐温20的百分比可改善由洗膜不充分导致的背景高的问题；