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问
质粒构建中,怎么在质粒上给基因加A尾?
迟C迟
平末端DNA加A的步骤一般是先纯化PCR产物,加入dATP Buffer,利用Taq 酶在平末端片段后加上A尾后才能与T载体的T头互补连接TA克隆。
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问
挑取单克隆时重组单克隆有没有一定的特点,和空质粒不一样的那种
Eason老歌迷
单克隆筛选是根据细胞所具有的特性将单个细胞从混合的细胞样品中分离出来的⼀种技术,是抗体制备细胞株优化、稳转细胞株构建、药物靶点筛选等应⽤中重要的⼀环。具有以下特点:通用性筛选:适用于多种细胞,无需携带抗性荧光标签。单列线性模式:适用于高价值细胞。提供克隆性证据:可为每个克隆提供克隆形成图像。温和的微流控技术:更高存活率,更低损失率。
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问
怎么对snp位点引入酶切位点,该点所在序列没有对应的酶切位点怎么办
Eason老歌迷
重组时选择你的目的基因上没有,而质粒的多克隆位点上有的酶切位点,一般重组质粒需要两个酶,所以你要选择两个酶切位点,注意尽量避免使用切出平末端的酶。重组引物设计时首先你要确定你选择的两个酶在的酶切位点在质粒的多克隆位点上的排列顺序,这个不能错,不然序列就会接反。一般设计重组引物的时候,在上游引物5’端前面加上载体多克隆位点排列在前面的酶切位点序列,在下游引物5‘端前面则加上后面的一个酶切位点,酶切位
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问
质粒构建过程中DNA扩增的问题?
汤姆卜丽波
退火温度可以做个梯度,找到最合适的
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问
严格厌氧菌的生长曲线测定
Eason老歌迷
三个标样平行试验的相对偏差应小于0.25%如果平行样相差大,那么你就得重新再做平行实验。是不是你没有摇匀呢?或者就是你吸样的时候没有操作好。
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问
DNA的检测结果可以通过外界(如药物)进行人为干预吗?
dxywode
可以的,通过研究人类的DNA,对可能发生的疾病进行提前预知,研发出个性化的DNA药物,可以让人类延长生命。
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问
体外转录,转录酶结合在DNA双链的哪条链上,怎么判断是以那一条连作为模版?
Eason老歌迷
RNA聚合酶上σ 亚基与启动子上特定区域的特异性结合,或者说启动子上特定的序列,就决定了哪一条是模板链。
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问
体外转录,模版DNA必须是双链吗,单链DNA可以作为模版吗?
bamboopiggy
单链DNA可以作为模板,但是起始必须是双链。DNA模板必须包含噬菌体聚合酶结合并开始RNA合成所需的双链启动子区域。转录模板包括经克隆构建的质粒、基于RNA前体进行第一链及第二链合成(例如aRNA扩增)得到的cDNA模板,以及通过PCR方法或对化学合成的寡核苷酸进行退火所得到的线性模板等。在设计转录模板时,必须确定需要的是正义链还是反义链转录本。若RNA是要用作与信使RNA杂交的探针(例如:Nor
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问
菌液pcr检测重组质粒跑出来条带很弥散,是怎么回事,胶没问题
bamboopiggy
菌落pcr 条带弥散没什么,因为菌落里很多杂七杂八的东西,只要你要的目的条带能出现就可以。或者也可能是你的buffer,或者是胶配的不匀,感觉你的marker也有点弥散
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问
在构建质粒时,菌落pcr的条带都是对的,但是测序结果都是缺少目的基因那一段,这是为什么呢?
汤姆卜丽波
可以做个菌液pcr再看看,有很大可能性是连接产物中有剩余目的基因,也可以单扩一个引物看看是不是引物污染,提个质粒跑一下
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问
磁珠法植物DNA提取试剂盒提取的核酸,纯度只有1.1左右,是什么原因?应该如何调整?
bamboopiggy
你的去蛋白液和漂洗液中是否忘记入无水乙醇?或者是你组织液氮研磨不充分?
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问
CTAB法提取植物基因组DNA总失败,怎么做才能成功?
Eason老歌迷
我觉得你可以注意以下几点。你磨样的时候一定要使材料处于低温状态。不然啊DNA降解得很厉害。加入异丙醇后,出现的DNA絮状物给他挑出来,不要离心,不然不完整的DNA会增多。
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问
qPCR产物跑胶电泳条带弥散,条带大小为一百多bp,尝试更换qPCR的条件以及电泳条件,结果依然如故,不知道什么原因
琴妞313
可能是引物浓度不对,建议重新定引物
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问
用KOD高保真酶做PCR扩增200+bp产物,模板含量低,延伸时间分别设1,5,10s,相对Taq酶出现很多非特异扩增,怎么办?
Eason老歌迷
可以适当的加入dmso,来增加特异性。也可以适当提高退火的温度
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问
DNA转录技术需要注意的易错细节有哪些?
Eason老歌迷
所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断 DNA 的可能性。提取 DNA 过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。 要用新鲜样品或液氮冷冻-70 度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性 DNA 的降解。
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问
移液枪里密封圈是什么材质的?
天一湖医者
NBR丁腈橡胶密封圈,HNBR氢化丁腈橡胶密封圈,SIL硅橡胶密封圈,
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问
磁珠法提取动物组织DNA,晾干时加热效果大吗?
Eason老歌迷
磁珠粒径小,磁含量少;磁性弱,亲水性不够;解决方案:筛选、替换匹配的磁珠。磁性分离器磁场弱,吸磁效果不理想;解决方案:选择高磁性分离设备,或增加磁吸时间。由于裂解不完全,导致样本黏度过大;样品裂解后,释放蛋白、其他杂质将磁珠紧紧包裹,影响磁吸效果。
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问
请问用trizol提取的DNA可以用于表观修饰的实验吗?(如甲基化、CHIP等)
Guoood
可以使用传统trizol 法提取DNA进行甲基化等表观遗传实验,用试剂盒纯度和浓度反而不如trizol 法
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问
如何在核酸扩增中减少污染现象?
迟C迟
样本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。 PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。PCR扩增产物污染:这是PCR反应
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问
我合成了一段序列,公司送来了液体状态的质粒,我做了转化,两天才长出来一个菌落,这个正常吗?
汤姆卜丽波
测一下质粒浓度,然后估计是抗性平板没选择对。
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