质粒构建过程中DNA扩增的问题？

退火温度可以做个梯度，找到最合适的

如果出现非特异性条带，可以考虑提高annealing temperature的温度，你可以做个梯度，看看哪个温度合适，或者你能切出你要的目的条带，就不要太考虑非特异的条带了。

PCR产物出现非特异产物跟反应体系，模板，引物浓度都可能有关系。模板cDNA质量要用好点的，引物浓度10-100pmol/ul都是可以的，dNTP2-4ul足够，体系要确保准确。

通过降低模板和引物浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，可以提高扩增特异性。此外引物设计的好坏是关键。除了按照常规引物设计规则外，构建载体时通常会在引物序列上添加酶切位点和保护碱基。