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琼脂糖凝胶电泳拖尾的具体原因有哪些,怎样避免
天一湖医者
原因有以下:1、 可以考虑是不是样品不纯,目的产物与杂带相差不大,所以要多跑一段时间才有尾巴。参考marker,marker应该不会有。如果有的话说明配胶有问题。2 、琼脂糖检测DNA一般去1~5微升原液,加2微升溴酚蓝便可,注意上样浓度;3、可能是原液浓度太大造成的;4、可能DNA已降解。5、在提取前对样品进行一定的脱腐处理呀。很简单。有一种TENP buffer,文献中查的到的。6、 DNA降
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问
用NEB的BpuEI酶1ul,切1ug的质粒失败,多加酶也不行,是酶量不够?应该用多少计量?
棋NKKP
酶切体系商业化很稳定,首先要确定自己的酶切位点是不是正确
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问
质粒构建中遇到的问题?
棋NKKP
在基因前插入要考虑移码突变的发生,而且不仅仅这一种会导致最终的不表达,还有很多原因
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问
有杂合位点,但是出现杂合信号的位置上只出现单一的信号,出现这种情况可能是什么原因造成的?求指点,十分感谢。
未来9
如果在您认为应该出现杂合信号的位置上只出现单一的信号,那么可能是您样品突变的模板与正常的模板的比例没达到可以测出的浓度。测序反应的信号强度直接与模板的量有关,如果突变的模板所占的比例很低,仪器会自动将它作为背景信号了,很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时,才能较可靠地检测到突变体的存在。其次,在同一位置,不同碱基的信号强度一般是不一样的,这样即使突变的模板所占的比例较高
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问
同源重组构载,抗性板上长的菌很少,而且都是假阳性菌
天一湖医者
应该是连接比例,或者载体酶切不彻底,目的片段等的问题,如果担心是自连状况,建议增加一个连接体系中只加载体、不加目的片段的对照,排除自连的问题
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问
双切酶体系中,两个酶的温度不一样,30和37该如何选择呢?
WineQ慕雪
先选择酶切低温要求的,再去酶切高温要求的
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问
怎么构建一种能在细胞中产生环状RNA的质粒?有什么参考资料?
汤姆卜丽波
参考一下这个文章https://wap.cnki.net/touch/web/Conference/Article/ZGXJ201711001258.html
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问
mRNA疫苗,质粒加A尾,怎么构建质粒?
汤姆卜丽波
就是基因工程的一部分,获取目的基因,载体。酶切,连接,转化,挑单克隆,验证。
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问
单酶切之后用T4连接酶构载,菌长了满板,pcr验证全是空载。
灵枢天问
这个体系是按摩尔比来的么,你测目的基因和载体浓度了么
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问
质粒构建中,pcDNA3.1(+)上,插入两个蛋白,选用什么启动子?各启动子会有干扰吗?
灵枢天问
CMV吧,如果是两个启动子合负责一个片段,那只要插入位点合适,没有其他干扰
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问
PCR产物跑完核酸胶以后泳道里有拖尾
汤姆卜丽波
有蛋白污染的可能吗?或者PCR的退火温度适当可以提高一些以减少引物和模板的非特异结合。适当减少PCR体系的模板量。
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问
CRISPR/CAS9质粒转染试剂以及靶位点DNA引物设计?
bamboopiggy
如果你习惯用PEI25K也是可以的,按照你平时做质转的配比做就可以。也可以直接转染你的肿瘤细胞收样做pcr,然后T7E1酶切。至于靶位点的引物,只要在靶位点上下游大概能产生700-900bp的pcr产物就可以。
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问
琼脂糖凝胶电泳拖尾的原因,用的是KOD酶预混mix做PCR,以前能跑出清晰条带,现将试剂都尝试换了遍,都没改善
dxy_oeu11rar
不知道marker是不是也有拖尾现象,如果marker正常,有可能是你的模板浓度太高。如果marker不正常,排查一下琼脂糖凝胶和缓冲液的问题,buffer不正确也可能产生拖尾
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问
这个是修改后的buffer,但是结果却找不到我的引物序列?有没有朋友知道的,求指导。十分感谢
天一湖医者
对于这种情况,如果你只是找不到扩增引物的序列,但是能找到后面所要扩增的序列的话,那么可能还是因为测序引物离你的扩增片断太近。如果不是这种情况,那么可能是你根本没有将扩增片断成功连入。当然还有一种可能是公司测序送错了结果。
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问
Tag1酶酶切后失败的原因?
mxy5120
限制性内切酶的量不够。酶切的时间不充足
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问
DNA重组相关问题?
急诊科ys
用高效连接酶连,400U或2000U,还可延长反应时间
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问
测序结果为什么看不到我克隆的酶切位点?
Junego
测序引物距离你的酶切位点有多长?如果引物到酶切位点过近或太远都测不到的。一条引物测序结果可信长度就700-800bp,要不换条引物试试。
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问
已经测序正确的菌液,再提质粒时发现酶切验证切不开,酶活性没问题。酶切位点之前也是切过得。是什么原因呢
dxy_l3h8h19
是不是操作有误啊?还有,已经测序正确了为什么还要酶切验证?如果是单酶切的话切没切开可能差距不大,看不出来有没有切开。
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问
用自配试剂提质粒时,p1溶液应该加多少RNA酶?P3和P2ph必须要达到规定值么?酚氯仿可以合并么?
dxy_oeu11rar
p1 RNAase的量我用的100ug/ml酚氯仿我用的是酚:氯仿:异戊醇=25:24:1p2没调过ph,p3的ph=4.8
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问
双酶切之后,为什么线性化质粒比环状质粒跑得快?
bamboopiggy
如果是完整质粒,应该是超螺旋的,跑的最快。但是感觉你这个lane像是开环带,就是双链dna有一条断开了,拖着尾巴,跑的慢。lane2 是线性带,跑的比开环带要快。
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