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        CRISPR/CAS9质粒转染试剂以及靶位点DNA引物设计?

        相关实验:全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选实验

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        葡萄提子529

        感觉大家转染的时候用的都是脂质体比如说lip3000,但其实PEI25k也是一种阳离子转染试剂。想问问大家,在筛选最有效的sgRNA所构建的质粒时,文献一般选用293T,因为我做的是肿瘤细胞,可以直接转染肿瘤细胞吗?有大佬试过用PEI25k来尝试吗?后续T7E1酶切如何准备设计靶位点DNA引物?PEI转染时涉及到的N/P比怎么计算?

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        3 个回答

        user-title

        Eason老歌迷

        有帮助

        可以的。293很常用。293细胞是人肾上皮细胞系,有多种衍生株,比如HEK293,293T/17等,来源都是人胚胎肾细胞,其极少表达细胞外配体所需的内生受体,且比较容易转染,是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系,是经过腺病毒E1A基因的转染,能表达SV40大T抗原,含有SV40复制起始点与启动子区。

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        bamboopiggy

        有帮助

        如果你习惯用PEI25K也是可以的,按照你平时做质转的配比做就可以。也可以直接转染你的肿瘤细胞收样做pcr,然后T7E1酶切。至于靶位点的引物,只要在靶位点上下游大概能产生700-900bp的pcr产物就可以。

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        天一湖医者

        有帮助

        PEI中43分子量对应一个N, DNA或者RNA中325/330分子量对应一个P,N/P计算根据分子量可以算出质量比,质量比接下来就好办了吧,比如PEI与DNA形成的复合物N/P=10,质量比就是10×43/330=1.3。

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