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        单酶切之后用T4连接酶构载,菌长了满板,pcr验证全是空载。

        相关实验:质粒构建技术

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        dxy_oeu11rar

        10ul的体系,加了1ul的buffer,1ul的酶,0.5ul的载体和7.5ul的片段

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        6 个回答

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        灵枢天问

        有帮助

        这个体系是按摩尔比来的么,你测目的基因和载体浓度了么

        user-title

        汤姆卜丽波

        有帮助

        全是空载的话是不是单酶切后没有载体去磷酸化?载体发生了自连?

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        bamboopiggy

        有帮助

        证明没有连接上,都自连了,你可以试试载体去磷酸化,插入片段加ATP,看看能不能提高一下连接效率

        user-title

        Junego

        有帮助

        1.单酶切多切一会儿,跑个电泳看看,加质粒做对照。

        2.酶切后加入碱性磷酸酶,防止载体自连。

        3.使用新鲜制备的线性载体和片段,调整载体和插入片段的比例试一下。

        user-title

        天一湖医者

        有帮助
        是不是产生了假阳性?扩大培养时抗生素失效?自己提质粒酶切鉴定一下再送测序吧。
        user-title

        未来9

        有帮助

        目的片段没有插入成功,但仍然长出菌落的这个现象可能由于以下原因:

        1、抗性失效了

        2、插入的片段不够纯

        3、有杂菌或被实验室里其他含有抗性的大肠杆菌污染了

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