质粒构建中遇到的问题？

在基因前插入要考虑移码突变的发生，而且不仅仅这一种会导致最终的不表达，还有很多原因

可以考虑一下是不是细胞的基因存在毒性，可能会是信号肽诱发的毒性

可能在构建中通过与促旋酶GyrA亚基第462位氨基酸相结合使得DNA断裂后不能进行修复，DNA合成受阻，导致细胞死亡。

是不是你的基因本身就有毒性？所以导致了大肠杆菌的死亡。加信号肽时你的引物设计是否有问题？否则不会出现目的基因序列的缺失的。

可能原因很多，比如在胞内无法正确折叠，不会致死，但是加了信号肽，能正确折叠了，毒性就出来了