病毒感染细胞实验

一、构建目的基因到载体构建手段，一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。（1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定（2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定二、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆

1．准备目的细胞（1） 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入 37℃ 水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。（2） 完全解冻后，1300 rpm，离心 3 min，75% 酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。（3） 吸去冻存液上清，加入 1 mL 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有 3 mL 完全培养基的 6cm 培养皿中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。（4） 24 h 后更换一

1．准备目的细胞（1） 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入 37℃ 水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。（2） 完全解冻后，1300 rpm，离心 3 min，75% 酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。（3） 吸去冻存液上清，加入 1 mL 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有 3 mL 含完全培养基的 6cm 培养皿中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。（4） 24 h 后更换

1．准备目的细胞（1） 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入 37℃ 水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。（2） 完全解冻后，1300 rpm，离心 3 min，75% 酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。（3） 吸去冻存液上清，加入 1 mL 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有 3 mL 含完全培养基的 6cm 培养皿中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。（4） 24 h 后更换

为了确认合适的感染条件，按照不同培养条件将实验分为 4 组：A 组：常规培养基组，观察常规培养条件下病毒对细胞的感染效果；B 组：添加 HitransG A（简称 A 液）的常规培养基组，观察 HitransG A 是否可以提升感染效果；C 组：添加 HitransG P（简称 P 液）的常规培养基组，观察 HitransG P 是否可以提升感染效果；Control 组：监控实验过程中细胞生长是否

在哺乳动物细胞中产生稳定的细胞系时，如果表达系统携带耐药基因，则通过在培养基中添加抗生素药物来选择稳定转染/转导的细胞是一种有效的方法。由于哺乳动物细胞对抗生素的敏感性因细胞类型而异，因此必须通过单独的杀伤曲线实验来确定杀死非转染或非转导细胞所需的抗生素的最低浓度

1.开胸与心脏注射开胸： 在左侧胸壁作皮肤切口，钝性分离胸肌，暴露肋骨。暴露心脏： 小心刺穿第4肋间隙，然后轻压胸腔，使心脏部分外露并稳定固定。多点注射： 将 30µL 病毒液分 3-5 个点缓慢注入左心室心肌壁。心脏还纳与排气：立即将心脏还纳，并轻压胸腔排出空气，直至观察到肌肉搏动恢复。这是防止气胸的关键步骤。2.缝合与术后恢复用缝线缝合皮肤切口（肌肉层无需缝合）。术后立即注射镇痛药，并将小鼠置

1.病毒注射定位与固定： 在 37°C 恒温垫上消毒后，将幼鼠仰卧固定，清晰地找到胸骨下端的剑突。进针点与路径：找到左侧肋骨与剑突的夹角作为进针点。从此点下针后，将针头紧贴胸腔壁，平行于肋骨向上推进约 3mm（直至被套管挡住）。注射与拔针： 缓慢注入病毒液体。注射完成后，务必在原位静置 10-15 秒，然后缓慢拔出，并用棉签轻压止血。2.复温与恢复立即复温： 注射后，立即将幼鼠转移至 37°C 恒

（1）GOI 质粒制备：将目的基因片段构建到腺相关病毒载体中，转化大肠杆菌。挑选含有目的基因的单克隆，扩大培养后提取质粒。（2）HEK293 细胞共转染：将 GOI 质粒、Helper 质粒(携带腺病毒来源的复制因子基因）和 RC 质粒（携带 AAV 复制和衣壳编码基因）共转染到 HEK293 细胞中。（3）病毒收获：转染 72h 后，从被感染的 293 细胞中收集 AAV 病毒颗粒。一般 AAV

1.病毒注射定位与固定： 擦干鼠尾，用酒精消毒后再次擦干。用拇指和食指绷直鼠尾，使一侧静脉朝上。始终从尾巴的远端（靠近尾尖）开始首次注射。进针： 将针头斜面朝上，以几乎与尾巴平行的极小角度，平稳地滑入静脉。推注与判断：成功标志： 推注活塞时应感觉不到任何阻力，部分品系小鼠可见注射点近端的血管瞬间变白。失败迹象： 若感到阻力或注射部位出现皮下鼓包，说明注射失败，应立即停止，拔出针头。再次尝试： 若初

1.病毒注射：双针技术制作穿刺口（巩膜预穿刺）：首先，使用锋利的 30G 针头，在角膜缘后方的巩膜上制作一个微小、表浅的穿刺口，为后续注射建立安全通道。插入钝头针：将已装载病毒的钝头针从此预制孔中轻柔插入。定位视网膜下腔：在显微镜下，将针头向眼球后方推进，直至首次感到轻微阻力。这是最关键的触觉反馈，表明针尖已到达 RPE 层，应立即停止推进。注射并形成「水泡」： 缓慢注入病毒。成功的注射，可通过观

1.病毒注射暴露肾脏： 在左侧腰部作~1cm 切口，将肾脏轻柔地挤出并暴露。血流控制：首先，用微血管夹夹闭输尿管。然后，用另一个血管夹同时夹闭肾动脉和肾静脉。成功的标志是肾脏颜色变为暗红色。肾盂注射： 将 PE-10 管的针尖插入肾盂（可见的白色小点），启动注射泵，在 1 分钟内注入 50 µL 病毒液。注射完成后，务必将血管夹和针头保持在原位 5 分钟，以使病毒在压力下充分灌注整个肾脏。5 分钟

1.病毒注射暴露肾脏： 在腰背部作一个 1-1.5 cm 的纵向切口，钝性分离肌肉和脂肪，直至找到肾脏。肾脏外置： 用湿润的棉签或弯镊，轻柔地将肾脏从腹腔中「钓」出，并稳定固定于切口旁。这是整个手术最关键的步骤之一。显微注射：在显微镜下，将针头以约 30° 角 插入肾皮质 1-2 mm 深。极缓慢地注入病毒液（建议用时 30-60 秒），以最大程度促进组织吸收。拔针前，务必在原位静置 10-15

1.病毒注射定位注射点： 用指尖在两侧髂骨最高点的连线上，找到脊柱中线的L5-L6椎间隙，这是理想的进针点。进针技巧（两步法）：首先，将针头（斜面朝向头部）在标记点垂直刺入，直至轻轻触碰到椎骨。然后，将针头角度减小至约30°，向头部方向稍稍滑动，使其滑入椎间隙。图片来源：https://app.jove.com/v/31924/intrathecal-delivery-viruses-mouse-

1.病毒注射暴露气管： 在颈部正中作一个 5–7 mm 的纵向切口。通过钝性分离肌肉和组织，清晰地暴露白色的气管环。固定与进针：用镊子轻轻固定住气管，防止其移动。将注射器针头以 45°角、斜面朝上，在气管环之间刺入。针头方向必须指向尾部（肺部方向）。注射与拔针：缓慢注入病毒溶液。注射完成后，务必在原位静置5秒，以使液体充分流入肺部，防止外漏。缓慢拔出针头。2.缝合与恢复用可吸收缝线缝合切口。将小鼠

1.插管与定向注射暴露声门： 在强光照射下，用镊子将舌头拉向一侧，此时可见随呼吸开合的声门。把握时机插管： 在小鼠吸气、声门完全张开的瞬间，将气管插管平稳、迅速地插入。定向给药：右肺： 将手术板顺时针旋转，使小鼠右侧向下，再注入病毒。左肺： 将手术板逆时针旋转，使小鼠左侧向下，再注入病毒。注射后，保持倾斜体位 30 秒，以利用重力使病毒液充分流向目标肺叶。2.恢复拔出插管后，将小鼠置于 37°C

1.手术与定位开颅： 沿头部正中线剪开头皮，暴露并清洁颅骨，清晰地找到前囟 (Bregma)。水平校准： 调整立体定位仪，确保颅骨前后、左右均处于水平状态，将前囟点设为三维坐标的零点。钻孔： 根据目标脑区的坐标在颅骨上定位，用颅骨钻在标记点轻柔地钻孔，直至刚好穿透颅骨，务必避免损伤下层脑组织。2.注射关键步骤下针： 将已装载病毒的微量注射器缓慢、垂直地降至目标深度。慢速注射： 以极慢的速率（如 0

（1）穿梭质粒（GOI 质粒）制备：将目的基因片段构建到慢病毒载体中，转化大肠杆菌。挑选含有目的基因的单克隆，扩大培养后提取质粒。（2）293T 细胞共转染：GOI 质粒和辅助质粒共转染到293T细胞中。（3）病毒收获：转染 48-72h 后，离心收集细胞上清液。（4）纯化浓缩：对上述细胞上清液进行0.45μm 过滤、超离、超滤、除菌等处理。（5）质量检测：滴度检测、物理状态检测和无菌检测。滴度检

1.病毒注射定位与消毒： 选取小鼠大腿后侧的股四头肌或胫前肌作为注射点。使用碘伏和 70% 乙醇交替对皮肤进行消毒。进针操作：将针头与股骨/胫骨方向保持平行，与皮肤表面呈 45-60° 角刺入。进针深度约为 2-4 mm，确保针尖进入肌肉层，避免过浅（皮下）或过深（触骨）。图片来源：https://research.unc.edu/wp-content/uploads/2021/06/mouse-

1.病毒注射固定动物：成年鼠： 固定，使其头部朝下倾斜，内脏前移。新生鼠： 用拇指和食指轻柔固定即可。定位与消毒： 找到小鼠腹部下方四分之一、偏离腹部中线的区域。用 70% 乙醇消毒。图片来源：https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/TECH%2010%20IP%20Injections%20in%20the%20Mouse%