腺相关病毒的包装流程

qPCR 检测法：

原理：该方法通过特异性引物和探针扩增病毒基因组特定区域，并实时监测荧光信号强度来定量病毒基因组。常用的靶序列包括ITR区域、载体中的启动子或转基因序列等。

应用场景：

AAV的生产研发；

早期工艺开发；

常规质控。

（1）GOI 质粒制备：将目的基因片段构建到腺相关病毒载体中，转化大肠杆菌。挑选含有目的基因的单克隆，扩大培养后提取质粒。

（2）HEK293 细胞共转染：将 GOI 质粒、Helper 质粒(携带腺病毒来源的复制因子基因）和 RC 质粒（携带 AAV 复制和衣壳编码基因）共转染到 HEK293 细胞中。

（3）病毒收获：转染 72h 后，从被感染的 293 细胞中收集 AAV 病毒颗粒。一般 AAV 颗粒会富集在包装细胞中，因此收集 HEK293 细胞，裂解释放AAV颗粒到上清中可以回收大部分 AAV 颗粒。

（4）纯化浓缩：对上述上清液多步纯化，去除细胞蛋白分子和碎片。

（5）质量检测：滴度、内毒素、衣壳纯度、空壳率检测等。滴度检测常使用 qPCR 检测法。