慢病毒包装流程

慢病毒常用滴度检测方法解析：

1、荧光显微镜计数法

原理：通过荧光显微镜直接观察和计数表达荧光蛋白的阳性细胞，估算病毒滴度。

 

操作流程：

将病毒进行梯度稀释并感染目标细胞；

培养 48-72 小时；

荧光显微镜下观察计数阳性细胞。

计算公式：TU/mL = 阳性细胞数 × 稀释倍数 / 感染体积(mL) 

 

优势：

设备要求较低；

可直观观察细胞形态和感染情况；

适合初步评估或小规模检测；

操作相对简便。

 

局限性：

统计效率低，样本量受限；

主观因素影响大；

精确度和重复性较低；

需要荧光报告基因。

 

2、qPCR检测法

原理：通过定量 PCR 检测整合到宿主细胞基因组中的病毒特定序列(如 WPRE 元件)拷贝数，推算活性病毒滴度。

 

操作流程：

用病毒感染靶细胞；

培养 48-72 小时后提取细胞基因组 DNA；

设计针对病毒特定序列的引物（如 WPRE）和内参基因（如白蛋白基因）；

进行 qPCR 反应，并与标准品比较；

计算每个细胞中整合的病毒基因组拷贝数；

换算为病毒滴度。

 

换算方法：每个细胞的慢病毒拷贝数 =（WPRE 拷贝数/Alb 拷贝数）× 2；

滴度（TU/ml）=（第 1 天的细胞初始数量 × 样本的每个细胞的慢病毒拷贝数）/ 使用的慢病毒体积（ml）。

 

优势：

适用于不带荧光标记的病毒；

检测灵敏度高；

操作相对标准化；

定量准确。

 

局限性：

需要专业 qPCR 设备和经验；

标准曲线建立要求高；

可能受 DNA 提取效率影响；

检测时间约 24-48 小时。

（1）穿梭质粒（GOI 质粒）制备：将目的基因片段构建到慢病毒载体中，转化大肠杆菌。挑选含有目的基因的单克隆，扩大培养后提取质粒。

（2）293T 细胞共转染：GOI 质粒和辅助质粒共转染到293T细胞中。

（3）病毒收获：转染 48-72h 后，离心收集细胞上清液。

（4）纯化浓缩：对上述细胞上清液进行 0.45μm 过滤、超离、超滤、除菌等处理。

（5）质量检测：滴度检测、物理状态检测和无菌检测。滴度检测常使用荧光显微镜计数法和 qPCR 检测法。