实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问96孔板，细胞洗板，枪头怎么不戳破细胞层，还能将培养液吸干

府宅

把细胞培养基靠一侧吸出来，尽量减少与板底部的接触，然后还要加pbs或者培养基洗2次，洗残余的药物（细胞未摄取的药物）

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问96孔细胞板洗板，细胞老是萎缩或者没了

dxy_gwrp7ndq

可以用排枪轻微吸打，然后再把细胞培养基靠一侧吸出来，尽量减少与板底部的接触，用吸水纸吸一下

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问免疫组化的切片相关问题

府宅

冰冻切片相比较于石蜡切片简单易行，一般进行固定脱水后，固定于包埋剂就可以在冰冻切片机进行切片。有些新鲜标本可以直接取材后，冷冻托涂包埋剂后置于冷冻托上速冻，冻好后立即切片。冰冻切片最重要的是防止样品中冰晶的出现，一般可以通过速冻的方法使组织温度骤降，减少样品内冰晶的形成。也可以将组织置于20％～30％蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

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问Wb半定量怎么做，怎么标定？

txs900416

所谓的半定量，是将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果，是一个比值差异的统计学分析。

1 回答485 围观

问做ELISA时可以两个板只做一条标准曲线吗？

txs900416

除非两个板的特性完全一模一样，每孔之间操作和间隔时间都相同，不然尽量在两个板上分别作标准曲线

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问人群血清IgG 正常值测定示例法的工作原理是什么？

府宅

单向免疫扩散实验——人群血清IgG 正常值测定示例发实验原理：将一定量抗体混匀于琼脂糖凝胶内制板、打孔、在凝胶孔中参加标准抗原溶液或待测样本。抗原在凝胶中向四周呈辐射状扩散并与凝胶中的抗体发生特异性结合反响，在抗原抗体比例适宜处形成白色沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比。以不同浓度标准抗原液制成标准曲线，通过沉淀环大小（直径）可在标准曲线上査出待测标本中相应抗原的浓度。

2 回答622 围观

问悬浮细胞的免疫荧光选取抗体时最好如何做选择呢，可以直接做荧光标记吗？

dxy_gwrp7ndq

选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于 rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是 donkey anti - rabbit - FITC （绿）和 donkey anti - rat － Tex - Red （红）。可以直接标记

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问wb 条带异常问题的出现原因？

dxy_gwrp7ndq

1、阴性结果的原因1) 二抗条件过低：提高二抗浓度、延长二抗孵育时间或孵育温度2) 一抗条件过低：提高一抗浓度、延长一抗孵育时间或孵育温度3) 抗原过少：提高上样量4) 抗体种属不兼容：一抗species reactivity中是否有需要检测样品的种属来源，一抗与二抗是否相匹配5) 酶活性：二抗上标记的HRP或AP等酶活性降低，如抗体过期或反复化冻等6) 封闭过度或封闭剂不兼容：降低封闭剂浓度、缩

3 回答2156 围观

问加非特异染色阻断剂后是直接甩去即可还是甩去后需要冲洗三次？

dxy_gwrp7ndq

除去PBS溶液，加100μl非特异染色阻断剂，室温下孵育10分钟。即直接甩去，不需要冲洗

1 回答264 围观

问请问一下包埋块切大了怎么办

府宅

最简单的方法就是把组织块修一下，分成2～3块包埋

3 回答311 围观

问间接法酶联免疫反应中如何控制二抗浓度？

dxy_gwrp7ndq

可以分别加入1：2000，1：10000，1：50000 二抗，进行滴定

2 回答320 围观

问请问Elisa实验需要几个技术重复呢？

府宅

ELISA实验要重复三次，每个样本做两个复孔

3 回答4795 围观

问流式连续表达怎么画门？

txs900416

一般会设置对照组，例如荧光减一组，isotype同型对照组，这样根据这种对照组区分阴性表达的上限，这样可区分连续表达分子的阴性和阳性。

3 回答1128 围观

问请问使用辣根过氧化酶（HRP）标记时，是否在后续的封闭液不能加叠氮钠？

府宅

叠氮钠会抑制辣根过氧化物酶的活性，在含有辣根过氧化物酶的溶液中不可加入叠氮钠。

3 回答646 围观

问wb怎么进行归一化，标定内参蛋白，如何确定上样量？

dxy_gwrp7ndq

你做好实验的“阳性对照”、“阴性对照”，然后保持与“试验处理样品”同样的样品上样量，再然后对pvdf膜进行剪切以及分别的抗体（内参抗体、目标蛋白的特异性抗体）孵育就可以很放心地做后续分析了。

2 回答2776 围观

问标本固定超过一个星期还有用吗？

府宅

标本放了一周能否使用，还与标本要做何种检查有关。若是做微生物学检查，活检标本放了一周则不能使用，因为微生物学检查需要保证活检标本的新鲜程度，放了一周的标本已经不够新鲜。如果是为了查病理或细胞学检查，不需要保证标本的新鲜程度，这时即使活检标本放了6天也能用。如果在取到标本当时及时进行了固定处理，这种标本可以较长时间的进行保存，保留一个月是仍然可以用的。否则，组织细胞会很快发生溶解破坏，长时间的放置

3 回答3748 围观

问请问Elisa法检测细胞实验中细胞因子的浓度的原理是怎样的呀？

dxy_gwrp7ndq

细胞因子的ELISA检测常采用双抗体夹心的方法进行检测，采用抗同一细胞因子不同表位的两株单克隆抗体，或一个单克隆抗体和一个多克隆抗体。一个抗体用于包被作捕获抗体，另一个抗体标记酶，作为检测抗体。

3 回答752 围观

问肝脏油红O的染色步骤

府宅

1. 油红O染色液的配制油红O染色液分储备液和工作液。①油红O储备液的配方：100%异丙醇100 mL+0.5 g油红O干粉，充分溶解，过滤，4度避光保存。②油红O工作液的配方：实验前，将储备液与蒸馏水按3:2稀释，过滤（滤纸或极性滤膜配1mL注射器），酒红色且无沉淀。现配现用原则，避免工作液出现沉淀。2. 60%异丙醇的配制60%异丙醇的配方：100%异丙醇60 mL+蒸馏水40 mL，4度保存

3 回答24622 围观

问western blot 转膜及条带问题

dxy_gwrp7ndq

1.洗膜不充分，增加洗涤液的体积和洗涤次数；在洗涤液中加入Tween=20。2.二抗浓度过高，引起了一些非专一性的抗原-抗体相互作用，适当降低二抗浓度，可以分梯度进行。3.二抗的识别抗原免疫簇不唯一，这是因为二抗是多克隆抗体，使用单克隆抗体的二抗，此时二抗的识别抗原免疫簇是唯一的，其非专一性的抗原-抗体相互作用会大为减少。当然，有时，单克隆抗体也会有识别抗原免疫簇不唯一，如果两种蛋白质的抗原免疫簇

3 回答542 围观

问染色最重要的操作步骤是哪个

bigred大红

样本前期处理和敷抗体都是关键步骤。

4 回答549 围观

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