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实验问答

31,797,198 科研人在看

问WB中BCA法标准曲线怎么做？

邓豆豆逗

找一个已知准确浓度的蛋白（一般试剂盒的话里面是有的），自己也可以用bsa配，然后稀释一个浓度梯度，比如2，1.5，1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1，0ug/ul，然后每个样至少三个复孔，做出来的od值和浓度做一个散点图，添加趋势线得到公式，然后再将样本的od值带入公式求得浓度就行了

3 回答1814 围观

问怎样提高WB实验蛋白定量与上样量的效率及准确性？

bamboopiggy

这个，只能说勤能补拙，多做，经验丰富了就好了。一般情况下，在做标曲的时候，加样要准确，标曲出来的R^2值，接近0.99最好。样品稀释时，枪尖要和枪match，吸液时，枪尖别下的太深。上样时，同样注意枪尖和枪的match程度，以及枪的准确性。

4 回答1022 围观

问蛋白质的等电点是否与蛋白质的质量有关？

天一湖医者

蛋白质是两性电解质，其等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关。各种蛋白质因氨基酸残基组成不同，等电点也不一样。

5 回答1523 围观

问磷酸化的抗体为什么总是杂不好

bamboopiggy

我牛奶和bsa都用过，这个其实是要看你的抗体好不好用，如果抗体好用，怎么杂怎么出。如果抗体不好用，一般都杂不好。此外，可以考虑在收样的lysis里面加点磷酸酶抑制剂。实在杂的难看，就换家公司买抗体，磷酸化的抗体，一般cst的还是不错的。

4 回答794 围观

问DTT特性在蛋白纯化和保存中有什么作用？

bamboopiggy

Cys存在于多种蛋白中，且其中的-SH常作为活性中心发挥作用，或者，两个-SH连接成二硫键，是维持蛋白质高级构象重要桥梁。-SH具有很强的还原性，溶液被溶液中的溶解氧或其它氧化物氧化，从使蛋白失去活性。所以，在蛋白纯化和保存时，在溶液中加入一定量的DTT，以免蛋白-SH被氧化而失活

3 回答3229 围观

问蛋白纯化实验前需要先做好哪些准备？

dxy_gwrp7ndq

对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料

3 回答1504 围观

问用于纯化的亲和层析填料形式有哪些？他们各自的优缺点是什么？

dxy_gwrp7ndq

分类及其优缺点：生物亲和层析生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的选择性。典型的物质对有酶﹣底物、酶﹣抑制剂、激素﹣受体等。免疫亲和层析利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统，称免疫亲和层析。免疫亲和层析应用相当广泛。此种方法的纯化蛋白倍数活性回收率非常高。用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品。免疫

3 回答2173 围观

问凝胶过滤层析过程中发现分辨率不高的常见原因有哪些？

府宅

1.加样要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25

4 回答2345 围观

问Strep tag(strep标签)有哪些特点？

天一湖医者

1.适合从真核或原核表达体系中纯化strep 标签蛋白2. Strep-Tag II 为8 个氨基酸（W-S-H-P-Q-F-E-K），不会影响标签蛋白的功能结构。3. Strep-tag 可以和His 标签蛋白联合使用，进行两步纯化获得超高纯度蛋白。

7 回答16750 围观

问Rt-pcr怎么样提高cDNA 的合成产量？

府宅

1.PCR反应体系的组成，如酶离子的浓度等也会显著影响；2.PCR条件，如引物的退火温度选择对提高PCR试验的灵敏度和产量也非常关键；3.如果PCR产量较低的话，你也可以通过二次PCR来提高产量，即把第一次的PCR产物适当稀释，再以它作为模班进行PCR，同时你也可以通过TOUCH-DOWN PCR来提高PCR的特异性和产量。

7 回答1248 围观

问Rt 的引物Oligo dt、随机引物、基因特异性引物，这三种有什么区别呢？哪种比较好呢？

bamboopiggy

一般情况下。反转录的kit里面带的引物就是oligo dt和随机引物的混合物，直接用就可以，除非你是想从其中调出你的特异性基因，然后得到cdna，做过表达，否则。不需要用特异性引物，否则翻转效率会很低。

3 回答3639 围观

问目标蛋白设三个孔，目标蛋白跑的都不齐，内参是齐的

未来9

可能是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶。处理办法：配胶时一定要充分混匀，待其充分凝固后再做后续试验

5 回答770 围观

问电泳实验怎么分析条带?

whilt-shirt

主要是用Image J分析灰度值，将目的条带与内参的灰度值相比，就可以得到你目的蛋白的相对表达量

5 回答1432 围观

问做wb实验每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？

邓豆豆逗

理论上可以的，但需要把握好每种抗体的稀释比，否则很容易因为某个抗体效果太好或者某个蛋白表达量很高而只能看到一个条带，而且抗体尽量选单抗，不然杂带太多也会影响其他抗体效果

8 回答3852 围观

问如果没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用于Western blot实验吗？

邓豆豆逗

可以尝试做一下，如果做出来条带位置正确的话就是可以用于wb，一般抗体官网标明的适用实验是他自己验证过的，其他没写的不是说不能用，而是他没有验证，望采纳

7 回答1023 围观

问在实验中无蛋白质的区域具有高背景是什么原因？要从哪些方面改进？

迟C迟

高背景可能是因为封闭不好：蛋白质转印到PVDF 膜或 NC 膜后，泳道与泳道间的空隙没有蛋白质；这时我们需要藉由额外的蛋白质缓冲液来填补其空白处。由于抗体本身也是一种蛋白质，因此若封闭作用不足，抗体可能会填进空白处的位置，进而造成高背景的结果。解决方案： a.封闭作用不足：这是其中一种可能的原因，提高封闭物浓度可确保封闭液完全复盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。 b.封闭液是否会与抗体反应：

3 回答721 围观

问如何通过DNAstar测序已知序列

迟C迟

DNAstar软件共有七个小程序，MegAlign则主要执行序列比对的功能。开启MegAlign软件首先需要点击File---New 新建一个工作文件，再点击File---Entersequeces 添加需要比对的序列，支持多种格式的文件（.seq;.abi;.pro;.fas等），点Ａdd可添加多个文件，点Done导入选中的文件。点Align选择序列比对的算法，其中多序列比对有三种算法：The

3 回答1173 围观

问如何才能跑满意的蛋白条带？求解决方法

迟C迟

WB实验要做的好，有以下几点需要注意：1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个

3 回答799 围观

问磷酸化蛋白背景深，且无条带

闭门羹牛

确保完全裂解并使用新鲜样本；在做磷酸化蛋白的整个实验过程中都要保证低温环境。磷酸化蛋白在室温条件下很容易被蛋bai磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以务必要保持低温环境！

4 回答588 围观

问请问，如何控制蛋白条带的灰度呢？

dxy_iel2g9hw

一些凝胶成像软件带有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。除了这些软件，还有一个比较简单的综合性质图像处理软件

4 回答357 围观

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