在实验中无蛋白质的区域具有高背景是什么原因？要从哪些方面改进？

高背景可能是因为封闭不好：蛋白质转印到PVDF 膜或 NC 膜后，泳道与泳道间的空隙没有蛋白质；这时我们需要藉由额外的蛋白质缓冲液来填补其空白处。由于抗体本身也是一种蛋白质，因此若封闭作用不足，抗体可能会填进空白处的位置，进而造成高背景的结果。

解决方案：

a.封闭作用不足：这是其中一种可能的原因，提高封闭物浓度可确保封闭液完全复盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。

b.封闭液是否会与抗体反应：这种情况较常发生在磷酸化抗体的使用过程中，由于牛奶含有casein这种磷酸蛋白，因此如果使用牛奶当封闭液，可能会产生封闭液与磷酸化抗体有非特异性的结合。这个情况下，建议使用BSA作为封闭液，同时搭配使用TBST的洗脱液来帮助降低高背景值的状况。

c.封闭时间不够：增加封闭时间也可以降低高背景值的结果，一般情况会使用室温37度封闭1小时，可视情况调整封闭的条件。

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　　抗体浓度过高

　　如果使用过高浓度的抗体，它们可能与印迹膜发生非特异性结合。 这将导致整个印迹的均匀高背景。 当使用超敏化学发光（ECL）时，有时噪音点甚至会在黑暗中发光。

　　解决方案

　　滴定抗体

　　为了降低由于高抗体浓度导致的高背景，需要滴定抗体，滴定一抗和二抗浓度。

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　　封闭不足

　　封闭膜是阻止抗体与膜非特异性结合的关键步骤。 通过在合适的封闭缓冲液中孵育印迹来实现充分的封闭。 封闭剂的类型，孵育的时间和温度可影响封闭效率。

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　　封闭试剂

　　封闭试剂的选择取决于特定的抗原：抗体相互作用，并且最好根据经验确定。

　　脱脂奶粉是常用的封闭液。 通常建议使用5％的牛奶来封闭，但有时这种高浓度牛奶会掩盖被检测的蛋白，特别是如果表达量低的情况下。 我们建议从1％牛奶开始。

　　牛奶可能与某些抗体和检测系统不相容，在这种情况下，3％牛血清白蛋白（BSA）是可以使用的第二种基于蛋白质的封闭试剂。

　　一些公司销售无蛋白封闭试剂， 不含蛋白的试剂可防止干扰，但也可与蛋白类封闭液联合使用，以增加封闭能力。

1.可能由于封闭时间过短或封闭缓冲液使用不当。大多数一抗基本不会和白蛋白或酪蛋白发生交叉反应。如果任何没有蛋白质的区域具有高背景，则封闭步骤可能无法正常工作。

2.一抗或二抗的浓度过高所致：适当降低抗体浓度。

3.洗涤不够充分：可以增加洗涤的次数。

4.孵化温度过高：一抗的孵育温度以4°C左右为宜。

5.转印膜选用不当，或者转印膜干燥：一般情况下选用PVDF膜具有较好的转印效果，同时防止膜干燥。

6.较高分子量的高背景也有可能是由于还原试剂、SDS或样品加热方式时长不正确。