磷酸化蛋白背景深，且无条带

抗体剥离液是用来去除已结合的抗体，可能是温度过高或时间太长但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。印迹膜一定要完全浸泡在含剥离液的容器中，置于 40-50℃ 恒温箱中，使受热均匀，摇床孵育 30 分钟。

压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。

建议压片时间要适当，不要太长或过短，太长则背景太深盖住想要的条带，时间过短则可能没有条带过条带过浅

确保完全裂解并使用新鲜样本；在做磷酸化蛋白的整个实验过程中都要保证低温环境。磷酸化蛋白在室温条件下很容易被蛋bai磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以务必要保持低温环境！