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实验问答

31,797,285 科研人在看

问怎么确定上样量呢？怎么计算？为什么WB条带会跑歪，那怎么处理呢？

府宅

这要根据你做的蛋白表达量多少，一般是用DAB显色要50-100μg，用ecl曝光上样量为20-40μg。但根据你蛋白表达量的不同目标蛋白绝对量DAB法至少50pg，ecl法至少20pg。

3 回答2346 围观

问RACE实验中，小胶跑的出来，胶回收却效果不理想怎么回事？

府宅

１）减少非特异性扩增。２）增加目的片段的产量。

3 回答821 围观

问wb怎么根据内参调整上样量

whilt-shirt

先用Image J计算内参的灰度值，然后选择其中一个样本作为参照，用这个参照样本的灰度值除以其他各组样本的灰度值再乘以各组上样量，就得到最终各自的上样量

3 回答15962 围观

问提高细胞支架材料的粘度性方式有哪些？

dxy_gwrp7ndq

最适合细胞粘附、增殖的材料表面应为中等湿润。运用等离子体表面改性技术，在高度疏水的P3/4HB 支架表面引入-OH、-COOH等基团，将材料表面的湿润度改善为中度亲水，为促进细胞的粘附创造了有利条件。

3 回答1819 围观

问ChIP-seq和ChIP-ChIP相比有哪些优势？

府宅

ChIP-seq在样品数量方面比ChIP芯片更具优势，因为ChIP-seq需要更少的量。ChIP-seq产生更精确的蛋白质结合位点列表和转录因子，增强子和序列基序的鉴定。可以使用ChIP-seq分析染色质和组蛋白变体的核小体定位和翻译后修饰。这种分析尤其受益于增强的空间分辨率。

3 回答1725 围观

问请问wb和免疫组化用的抗体大多是通用的吗？说明书里要注意啥？

dxy_gwrp7ndq

一抗是否能够通用，还要看你购买的抗体说明书上是否标有IHC的字样。一般来说WB和IHC检测时候对一抗的要求是不同的，但是很多抗体也能通用，这是抗体生产厂家进行了检测。至于二抗，如果没有其他交叉反应，也是可以用于IHC的。

3 回答1952 围观

问蛋白浓度测定除了BSA方法，还有没有其他方法？

天一湖医者

还有紫外吸收法，双缩脲法，BCA方法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等

4 回答946 围观

问蛋白稀释梯度一般怎么设定

府宅

用考马斯亮蓝法时，稀释蛋白的倍数主要取决于标准曲线的情况。

3 回答1007 围观

问免疫荧光实验蛋白荧光太强，甚至形成非特异性的标记。背景染色无法区分阳性区域，怎么办？

dxy_gwrp7ndq

如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间。可能是自体荧光，想知道组织是否有自体荧光，查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤，可以避免使用戊二醛固定，或者使用含0.1% 氢硼化钠的PBS洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子，可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。

3 回答916 围观

问免疫荧光实验目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果是什么原因？

府宅

通过文献等查找一下目标蛋白在该组织或细胞的表达丰度如何。若该蛋白本身表达就很少。如果抗体修复不充分，抗原表位未完全暴露，也会出现弱标记现象。比如，尽管大多数抗体都是在酸性环境中修复，但是也存在少量的抗体需要在碱性环境中修复，建议查看抗体说明书，严格按照其修复条件进行实验。

3 回答830 围观

问怎样提高蛋白质在醋酸中的稳定性？

天一湖医者

1、尽量在相对密封和无菌的环境下快速进行分离操作2、在生理温度和压力范围内完成分离纯化操3、慎用溶剂和酸、碱、盐类，使用前要进行详细的试验，确定最佳添加量和条件;4、钝化或抑制蛋白质分解酶类的活性;5、选择合适分离方法。如:凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析、电泳、结晶等。

4 回答837 围观

问关于WB实验显色问题？

dxy_gwrp7ndq

做ECL的一抗浓度比DAB染色稀释10倍或20倍，适当缩短曝光时间，曝光前将膜上多余的ECL液空掉。

3 回答1987 围观

问原核表达中，IPTG诱导过程中，有必要摸诱导温度吗，一般最适多少度啊？

dxy_gwrp7ndq

建议室温和37度，做时间曲线(0,1,3,5,过夜)，IPTG用0.2mM，电泳检测

3 回答2690 围观

问免疫共沉淀实验的注意事项，外源IP为何只能正抓或反抓成功

府宅

1.抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。2.溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原

3 回答745 围观

问蛋白提取研磨和破碎法选择

dxy_gwrp7ndq

研磨的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离，破碎细胞的程度比组织捣碎机高。超声处理的频率一般选在10KC至200KC，功率200-500瓦范围，处理时间有数分钟至数十分钟不等，处理过程中注意冷却。此法多用于微生物材料。

3 回答1503 围观

问蛋白标记实验，无蛋白质的区域具有高背景，怎么分析

府宅

检测试剂中的蛋白质抗体与特异性抗原结合，同时非特异性抗原同时也会非特异的结合在固相上的空白区域，产生高背景

3 回答641 围观

问rna的二级结构对全长rna反转录有何影响？怎样排除影响因素？

dxy_gwrp7ndq

AMV在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍

3 回答1642 围观

问蛋白纯化常用的标签有哪些？

dxy_gwrp7ndq

常用的标签有His标签、GST标签、Strep II标签、MBP标签、Flag标签、 Myc标签、SUMO标签、组合式的双标签

6 回答2831 围观

问怎样减少值 RNA 酶污染的机会？

dxy_gwrp7ndq

必须确保与纯化的rna接触的每一样东西都是无rnase污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备，都必须用表面去污净化溶液如rnase喷雾清除剂处理过，去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的rnase污染，可以用rnasafe。必须保证一直使用无rnase的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换。

3 回答1392 围观

问蛋白质电泳图谱精度怎么控制？

wuli猫宁

根据聚丙烯酰胺凝胶薄片上蛋白质电泳带的粗细、深浅和迁移率，绘制电泳图谱，并计算相似率。

3 回答542 围观

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