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        Rt-pcr怎么样提高cDNA 的合成产量?

        相关实验:ELISA 实验

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        RIRI00

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        7 个回答

        user-title

        府宅

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        1.PCR反应体系的组成,如酶离子的浓度等也会显著影响 ;

        2.PCR条件,如引物的退火温度选择对提高PCR试验的灵敏度和产量也非常关键;

        3.如果PCR产量较低的话,你也可以通过二次PCR来提高产量,即把第一次的PCR产物适当稀释,再以它作为模班进行PCR,同时你也可以通过TOUCH-DOWN PCR来提高PCR的特异性和产量。

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        dxy_gwrp7ndq

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        1)PCR的体系组成的合理,尤其是适宜的引物和模板的浓度,如果某种成分的量加大或减少都会显著的影响PCR的产量和特异性;

        2)合适的模板浓度:起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数扩增满意,104到106个起始目的分子就足以在溴化乙锭染色胶上观察到,所需的最佳模板量取决于基因组的大小;

        3)酶的选择:除了使用高质量模板DNA,聚合酶的选择也会影响产量;

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        未来9

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        随机引物虽能确保长基因的 5’末端的转录,但并不能获得 整个基因全长的 cDNAs,且对 RNA 样品质量要求比较高,此时可用 6-8 个核酸聚合体来提 高 cDNAs 的合成量

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        bamboopiggy

        有帮助

        首先要提高mRNA的质量,260/280,260/230,都要在1.8-2之间,然后将mRNA稀释到100ng/ul左右进行反转,使用带gemonic dna Romover的rt kit,一般得到的cdna是可以的

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        whilt-shirt

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        使用进口的逆转录试剂盒,加大RNA模板浓度

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        迟C迟

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        提高逆转录的效率和灵敏度:

        1)选择合适的逆转录引物

        逆转录引物选择指南 特征优点缺点结合方式Oligo (dT)1)12-20个T;2)与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对。可合成全长cDNA。

        1)仅扩增有polyA尾的mRNA;2)对模板质量要求高。 Random Primers1)6-9个碱基;

        2)可随机识别模板并结合。适合复杂结构和微量模板。特异性低,小片段多。 基因特异性引物(GSP)识别特定模板序列。特异性强,灵敏度高。仅合成特定的序列,不适合研究同一个样本中多个基因。 2)选择合适的逆转录酶

        对于逆转录酶的选择,目前科研领域常用的逆转录酶主要有AMV, MMLV,以及基于这两种酶改造的其他逆转录酶。Yeasen Hifair酶经过分子改造后,删除了MMLV原有的RNase H活性,避免了模板RNA的降解;同时具有更高的反应温度,针对一些高GC含量,以及富含复杂二级结构的RNA模板具有更强的逆转录效率

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        dxywode

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        成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇,室温放置3-5分钟,10,000×g离心5分钟。

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