实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问EMSA反应后条带弥散

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检查探针上是不是有很多蛋白的BINDING SITE ？尝试减少曝光时间，EMSA 要在正常实验前要试一下不同BUFFER，高盐低盐等对结果的影响，建议从头摸索一下实验条件。另外考虑是不是跟胶聚合有关系。配胶的试剂是否新鲜，聚合是否充分。核酸电泳的时候，胶不好跑出来有时就会拖拖拉拉的。

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问trizolRNA提取的具体步骤有哪些？

whilt-shirt

称取组织约50mg置于2mLEP管中，剪碎；加入Trizol试剂1mL，匀浆器研磨成浆，移入新的1.5mL EP管中，吹打混匀，室温静置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀，冰上静置5min，4℃ 15000g离心15min；吸取上层透明液体至新开启1.5mL EP管，加入500μL异丙醇，轻轻上下颠倒两次混匀，-20℃冰箱静置30min，4℃ 15000g离心15min；加入200μL 7

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问蛋白浓度较低，如何提高上样量

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选用10孔的梳子，增加上样体积，提高总蛋白量

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问RNA提取后，跑电泳无条带是什么原因？

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有可能是提取时样品量太大了，不要往RNA提取试剂里加太多液氮研磨的组织样品，因为一般来说RNA提取试剂一般加1ml ，这时如果加太多样品的话，1ml的RNA提取试剂抑制不了过多的样品中所含有的RNA酶，所以RNA在提取过程中就会降解。

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问怎样更好的跑出蛋白条带

dxy_gwrp7ndq

1.制胶：先制分离胶，再制浓缩胶，严格按照制胶说明书来就可以了。需要注意的一点是制胶一定要混匀！混匀！混匀！个人经验是每加一种试剂，就混匀一下，直到最后一种试剂加完。对于初学者，还要区分制胶的玻璃板是 1.0cm 还是 1.5cm 的，两者需要的制胶液体量是不一样的。另外，玻璃板一定要洗干净，本人平时都是用洗洁精洗干净然后用水冲洗最后用纯水冲洗，再放在烤箱里烤干并晾至室温。 2.点样：点样的过程

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问免疫组化两步法和三步法有什么优缺点呀？

dxy_gwrp7ndq

三步法是一般是最常用的免疫组化方法，敏感度高高的，操作上面也十分简便。如果组织内源性生物素过高，就容易造成了假阳性显色。内源性生物素在肝，肾组织中的含量尤其多，在脾、胰、脑、乳腺、子宫内膜和骨骼肌等组织中也广泛存在，因此，避开内源性生物素的感染，才最为关键。二步法利用多聚HRP代替了Bioten，这一招移花接木，从技术上克服了组织内源性生物素造成的非特异性的背景染色。二步法在避免了生物素干扰的同时

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问蛋白质复性的时候，为什么加入尿素可以增加溶解度，但是尿素会使蛋白质变性，这是为什么呢？

dxy_gwrp7ndq

尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性,使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加天然蛋自质分子中的肽链以一定的方式盘绕曲折，形成特定的构象。这种构象的维持，主要依赖于蛋白质分子中的氢键。尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性。尿素对球状蛋白质变性作用有两点，一是降低蛋白质非极性基因与水的疏水作用，二是尿素对蛋白质酰胺、肽基团的亲和力增强，这两个因素使蛋白质处于一种

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问为什么格林巴利病人免疫功能有缺陷

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格林巴利是一急性或亚急性发作慢性损害神经根及中枢神经的脱髓鞘疾病，其病发严重时可侵犯高位脊髓前侧角细胞和脑干神经核以及大脑运动皮质锥体细胞危机生命，属免疫性疾病，大多属病毒感染所致。

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问之前跑还有条带，重新跑PCR就没条带了，这是什么情况？求解答

刹那芳华2333

检查一下是否是pcr的体系或者反应条件的问题，或者样品存在污染，琼脂糖的浓度或者eb浓度是否有问题

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问ELISA实验常用的酶有哪几种？

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ELISA是利用酶催化反应的特性来检测和定量分析免疫反应。常用的酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

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问免疫荧光为什么单标红色出来的是粉红色

丁香粉猪猪

标本固体色调制不对，可能显微镜或者固体液不对，调试一下

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问要测的蛋白的标准分子量在哪个网站上或书里查找呢？

菲菲飞呀飞

NCBI上可以查分子量，还有其它的方也可以查。我推荐几个吧：Genecards: www.genecards.orggentlas:genatlas.medecine.univ-paris5.frUniprot:http://www.uniprot.org

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问蛋白质纯化实验相关问题

菲菲飞呀飞

1、在进行一个蛋白纯化之前，应该对其蛋白有所研究，包括其性质，敏感性，例如该蛋白的溶解性，对高盐或pH敏感，是否容易氧化等； 2、需要考虑蛋白质的用途，来决定制备蛋白的量级规模，这就要考虑到层析柱的尺寸，得到的蛋白浓度如何，是否需要保持其活性以及避免不必要的污染物；

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问出现干片的情况还可以复原吗？有什么方法补救？在实验过程中哪些步骤容易导致干片？

dxyv9281

组织过于干燥会出现干片，可以延长浸泡次数和时间

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问除了使用不含叶酸的培养基外还有没有其他方法避免微量叶酸干扰

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叶酸含有1个或多个谷氨酰基，天然存在的叶酸大都是多谷氨酸形式。叶酸的生物活性形式为四氢叶酸。叶酸为黄色结晶，微溶于水，但其钠盐极易溶于水。不溶于乙醇。在酸性溶液中易破坏，对热也不稳定，在室温中很易损失，见光极易被破坏。

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问实验数据的收集和分析有没有好的软件推荐？

菲菲飞呀飞

1、Excel 为Excel微软办公套装软件的一个重要的组成部分，它可以进行各种数据的处理、统计分析和辅助决策操作，广泛地应用于管理、统计财经、金融等众多领域。 2、SAS SAS由美国NORTH CAROLINA州立大学1966年开发的统计分析软件。SAS把数据存取、管理、分析和展现有机地融为一体。SAS提供了从基本统计数的计算到各种试验设计的方差分析，相关回归分析以及多变数分析的多种统计分析过

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问蛋白质样本提纯方面近年来有什么新的进展？

菲菲飞呀飞

膜分离纯化方法超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜，也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。目前超滤方法研究工作主要集中在膜材料选取方面。潘巧明[4]探讨了大豆蛋白浓缩的工业化生产中，各种条件对聚矾中空纤维膜性能的影响。

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问RNA的电泳检测问题

府宅

跑15%的胶时电压换为120V或者更高就可以了。

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问免疫层析胶体金定量试纸如何确定加样量

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胶体金试纸条胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。定量的胶体金试纸是通过抗原抗体复合物反应显色，然后再根据灰度值通过拟合的线性方程（灰度和浓度的二元方程）求出灰度对应的浓度值，即检测结果。

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问单细胞测序怎么样最大程度的减少误差呢？要从哪里方面做呢？

whilt-shirt

样本准备原则（1）建议使用宽枪头重悬，以减少对细胞的损伤；（2）每次移液前先混匀细胞悬液，然后从管中部吸取；（3）所有环节都最好在无菌环节下操作、使用无核酸酶的试剂、减少移液步骤以及当可能损伤细胞的时候尽量使用宽枪头等。此外，可用一次性转液管去除离心后的上清液，以减少细胞沉淀的干扰；（4）取样的时候最好设置两个重复，对每个样品计数 2 次，即共计 4 次计数；（5）弃上清时候注意不要破坏细胞沉淀；

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